林傳行 綜述，周寶寬 審校

（天津醫(yī)科大學化學教研室，天津300070）

2010年，在醫(yī)藥工業(yè)中，化學藥物銷售超過7000億美元，具有光學活性的手性藥物(chiral drug)約占全部化學藥40%～50%，規(guī)模約3200億美元[1]。而這一發(fā)展趨勢的內(nèi)在驅(qū)動力來自于單一對映體手性藥物，因此，獲得單一對映體手性藥物成為關(guān)鍵。由于酶中心本身是一個不對稱結(jié)構(gòu)，且有高選擇性，單一性強，產(chǎn)品光學純度高，能在溫和條件下高效、專一地催化各種生物化學反應(yīng)，因而，研究表明，酶催化法對手性藥物的合成與拆分是一種有效的方法，具有廣泛的應(yīng)用前景。

1 酶催化法對手性藥物的合成

酶催化法對手性藥物的合成就是以酶作催化劑合成高對映體過剩值(enantiomeric excess，ee）和好收率的單一對映體，即利用酶促反應(yīng)的高度立體、活性和區(qū)域選擇性將前體化合物不對稱合成各種復(fù)雜的手性化合物，該法反應(yīng)條件溫和、高效率、無毒性和環(huán)境污染，符合綠色化學。目前，該法在手性藥物合成中主要用于催化4種類型的反應(yīng)：不對稱還原；不對稱水解及其逆反應(yīng)；不對稱氧化；裂解反應(yīng)。

1.1 酶催化法的不對稱還原反應(yīng) 該法就是將分子中的酮基或碳碳雙鍵立體的還原產(chǎn)生特定結(jié)構(gòu)型化合物的反應(yīng)。劉湘等[2]研究了利用酵母細胞中所含的酶催化芳香酮的不對稱還原反應(yīng)，考察其產(chǎn)物(S)-1-苯基乙醇的對映性選擇的影響，同時他們還考察了芳香酮結(jié)構(gòu)對產(chǎn)物對映性的影響。Jing等[3]通過基因工程構(gòu)建重組菌的方法，克隆了來自擲孢酵母的醛還原酶基因，發(fā)現(xiàn)重組菌的酶活性是從擲孢酵母直接提取純化的酶的15倍。他們將重組酶用來不對稱還原4-氯-3-羰基乙酸乙酯（Ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate,COBE），將其還原成（R）-或（S）-4-氯-3-羥基丁酸乙酯（Ethyl 4-chloro-3-hydroxy-butanoate，CHBE），顯然產(chǎn)率和ee值都有所提高，產(chǎn)率為98.5，ee值為99%。Rita等[4]利用源于超嗜熱菌Pyrococcus furiosus的脫氫酶，以異丙醇為共底物，在40攝氏度條件下，并且以NADP(H)為輔助因子，催化苯乙酮得到ee值大于99.5%的(S)-醇。Asako等[5]研究了某種重組大腸桿菌中異源表達的青霉菌中的一種β-酮酯還原酶，命名為AKR3E1，發(fā)現(xiàn)這種異源表達的酶能立體選擇性還原4-溴-3-羰基甲基丁酸（Methyl 4-bromide-3-oxobutyrate, BAM）可以生成（S）-4-溴-3-羥基甲基丁酸，并且ee值比較高，達到97.9%。

1.2 酶催化法的不對稱水解 該法利用在水解酶的催化下，兩種對映異結(jié)構(gòu)體水解反應(yīng)的速度不同。目前大部分能夠催化不對稱水解反應(yīng)的都是水解酶，尤以不需輔酶的脂肪酶應(yīng)用廣泛。布洛芬是常用的抗炎鎮(zhèn)痛藥物，廣泛用于治療頭痛，據(jù)研究報道，消旋布洛芬的兩個對映體中（R）-對映體并無抗炎特性，而只有（S）-對映體具有抗炎的作用[6]。最近，Liu等[7]利用一種來自子囊菌酵母的胞外脂肪酶LIP，在0.1mol·L-1磷酸緩沖溶液（pH值=8）中，催化水解（S）-布洛芬酯，得到了高純度的（S）-布洛芬，ee達到98%。Long等[8]通過基因工程的方法使粘質(zhì)沙雷菌ECU1010的一種脂肪酶在大腸桿菌中表達，研究發(fā)現(xiàn)這種異源表達的脂肪酶能選擇性水解（R，S）-酮洛芬酯，將其水解成（S）-酮洛芬，ee值為91.6%，重組脂肪酶表現(xiàn)了比較高的立體選擇性，這給我們提供了另一條途徑去開發(fā)得到具有更高活性，立體選擇性更好的脂肪酶。Bae等[9]致力研究將（R，S）-氟比洛芬乙酯轉(zhuǎn)化成（S）-氟比洛芬，最終發(fā)現(xiàn)粘質(zhì)沙雷菌ES-2的脂肪酶可以對其立體選擇性水解，并且ee值高達98.5%。由此可以表明酶催化法的不對稱水解在手性藥物獲得中有其重要作用，特別是脂肪酶的廣泛應(yīng)用。

1.3 酶催化法的不對稱氧化反應(yīng) 該法將分子內(nèi)的碳氫鍵或雙鍵立體選擇性氧化，產(chǎn)生特定構(gòu)型的羥基化合物或環(huán)氧化合物[10]。手性亞砜及其衍生物是重要的輔劑和手性配體、手性中間體以及手性藥物[11]。Vargas等[12]利用從真菌Caldariomyces fumago中分離出來的一種應(yīng)用非常廣泛的氯過氧化物酶，氧化一系列的β-羰基硫化物，條件是在檸檬酸鹽緩沖液（pH=5.0）和室溫條件下，結(jié)果得到了相應(yīng)的手性亞砜。（S）-（-）-4-溴-1，2-環(huán)氧丁烷和（R）-4-羥基-1，2-環(huán)氧丁烷，它們是合成某些抗真菌和抗焦慮藥物的重要中間體。近些年，有人利用甲烷單加氧酶的休止細胞催化相應(yīng)的烯烴環(huán)氧化制備得到了這些重要的中間體。同時他們利用ω-羥化酶合成β-阻斷劑類藥物Atenolo和Metopropol，先生成有效高對映體過量值的（S）型環(huán)氧手性骨架，然后再用化學方法進一步加工修飾獲得最終產(chǎn)物。

1.4 酶催化法的裂解反應(yīng) 就是利用某些裂解酶的催化活性進行手性分離。在自然界中羥基腈裂解酶可以催化腈醇的合成，Purkarthofer等[13]首次報道了酶催化的不對稱Henry反應(yīng)，而它們利用的正是這種酶，應(yīng)用于一系列的醛和硝基甲烷的Henry反應(yīng)。條件是以叔丁基甲基醚（TBME）和水兩相為反應(yīng)體系，在室溫下反應(yīng)，ee值高達99%，產(chǎn)率77%，同時還發(fā)現(xiàn)pH值對反應(yīng)的產(chǎn)率和ee值的影響都比較顯著。此外，作者還研究了苯甲醛和硝基乙烷在羥基腈裂解酶作用下反應(yīng)，也取得了良好的效果，anti:syn可達9:1，anti異構(gòu)體的ee值可達95%。

2 酶催化法對手性藥物的拆分

主要是指利用酶的高度立體選擇性進行消旋體的拆分，以獲得純的光學活性物質(zhì)，并且具有催化效率高，專一性強，產(chǎn)品光學純度高等優(yōu)點。

2.1 直接拆分外消旋體 即直接拆分法，通過酶催化法與對映異構(gòu)體反應(yīng)，生成非對映異構(gòu)體，利用它們之間各種性質(zhì)的差異，用非手性的方法將它們分離開來，最后分解所要的非對映異構(gòu)體得到需要的單一手性化合物。（S）-7-甲氧基-1，2，3，4-四氫-萘-2-醇是合成對帕金森病有較好療效藥物的重要中間體，晁龍飛等[14]運用化學方法合成了7-甲氧基-1，2，3，4-四氫-萘-2-醇，并通過運用生物酶催化法得到了手性化合物 (S)-7-甲氧基-1，2，3，4-四氫-萘-2-醇，并篩選出了適合該體系的酶Novo2ym 435，而且還確定了最佳反應(yīng)時間為7.5h。徐剛等[15]在制備（S）-2-氯-1-（2-噻吩）-乙醇的過程中，通過對不同來源酶的篩選，最終找到了兩種選擇性較好的酶Alcaligenes sp和Novo2ym 435，有效拆分制備了（S）-2-氯-1-（2-噻吩）-乙醇，ee值達98.5%。

2.2 去消旋化法 也稱作對映體收斂轉(zhuǎn)化法，就是將外消旋體純化，利用酶催化反應(yīng)將一種對映體轉(zhuǎn)化成其對映異構(gòu)體，從而得到單一手性藥物[16]。隨著多相反應(yīng)器、酶固定化等新技術(shù)的日趨成熟，越來越多的酶已用于外消旋體的拆分[17]。Dunsmore等[18]利用某種有光學選擇性的胺環(huán)氧化酶，實現(xiàn)了手性胺的制備，該酶只氧化（S）-對映體為亞胺，而亞胺又可以被還原為外消旋胺，他們這樣重復(fù)操作，最終獲得了單一對映體，產(chǎn)率和ee值都很高。在仲醇去消旋化反應(yīng)的研究過程中，發(fā)現(xiàn)許多微生物系統(tǒng)中的醇類脫氫酶可以直接催化這類反應(yīng)，但去消旋化過程中一般有2種不同的具有對應(yīng)體選擇性的醇類脫氫酶的參與。Comasseto等[19]研究發(fā)現(xiàn)多種真菌，都能用于催化間位或鄰位氟苯1-乙醇發(fā)生去消旋化反應(yīng)，反應(yīng)的產(chǎn)率和對應(yīng)體過剩值都很高。2.3有機溶劑下酶法拆分 該方法區(qū)別于酶催化水解反應(yīng)，而是利用有機溶劑為反應(yīng)介質(zhì)，克服了水為溶劑時酶回收問題。其中Zaks等[20]致力研究酶在有機溶劑媒介中的催化條件和特點及相關(guān)影響因素，發(fā)現(xiàn)以有機質(zhì)為溶劑具有一定的潛在應(yīng)用價值，并且酶更利于回收。Gill等[21]通過利用南極假絲酵母脂肪酶B（CALB），在以叔丁基甲基醚（TBME）作溶劑的條件下，拆分1-（3-溴）苯乙胺，底物的對映體過量值大于99%。2002年，Liu等[22]利用螢光假單胞桿菌脂肪酶水解法拆分乙?；?1，2-二醇和熒光假單胞桿菌脂肪酶在有機溶劑中通過?；ú鸱至艘阴；?1，2-二醇相對比，發(fā)現(xiàn)酶的?；人夥磻?yīng)更有效，同時酰基化的不可逆性提高了光學純度。

2.4 酶膜法拆分 酶膜法就是先用酶水解底物，再利用膜的選擇透過性分離產(chǎn)物，實現(xiàn)反應(yīng)分離一體化。最近，尚雁等[23]利用乳液酶膜反應(yīng)器（E-EMR）進行外消旋萘普生甲酯的水解反應(yīng)，乳液酶膜反應(yīng)器是新型的酶膜反應(yīng)器；E-EMR為界面活性酶提供了良好的酶促拆分反應(yīng)環(huán)境，實現(xiàn)了ee值達到100%，獲得了光學純對映體（S）-萘普生。Ong等[24]通過研究，發(fā)現(xiàn)相比游離的南極假絲酵母脂肪酶B（CALB），如果將CALB固定于酶膜反應(yīng)器中，可以降低對映分離（R，S）-酮洛芬所需酶的量，同時ee值也有所提高，為87.8%。

3 手性藥物的酶催化不對稱定向合成技術(shù)的新進展

近年來，隨著生物技術(shù)的進步，特別是非水相酶促反應(yīng)的發(fā)展，利用酶和微生物進行的手性化合物轉(zhuǎn)化和合成獲得的成功引起了有機化學家的極大關(guān)注。此外，超臨界流體技術(shù)的出現(xiàn)以及超臨界流體技術(shù)在酶催化反應(yīng)等領(lǐng)域的應(yīng)用也是一個發(fā)展方向，在許多情況下，酶催化反應(yīng)在有機溶劑中因反應(yīng)太慢而不能應(yīng)用于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。超臨界流體是指超過了物質(zhì)的臨界溫度和臨界壓力的流體，最常用的為超臨界CO2，它既具有與氣體相似的粘度，又兼有與液體密度相近的特性，是處于氣態(tài)和液態(tài)之間的中間狀態(tài)的物質(zhì)，因此它具有傳質(zhì)速率快，密度、介電常數(shù)等物理性質(zhì)對溫度和壓力變化敏感等優(yōu)點[25]。在超臨界流體中，由于它傳質(zhì)阻力很小，反應(yīng)速度得以大大加快，而且有機溶劑在超臨界液體中的溶解能力很好，在待拆分的消旋體中加入適量的手性識別劑，使其轉(zhuǎn)換成非對映體（一般情況下為非對映體鹽）。利用非對映體本身的溶解性差異以及它們在超臨界流體中溶解性的差異使得消旋體更容易拆分，同時它的下游處理和溶劑回收也更加方便，對手性化合物的合成和外消旋體的拆分是一種很好的反應(yīng)體系[26]。

酶催化法對手性藥物的合成與拆分在手性藥物制備中已得到廣泛的應(yīng)用，主要是因為酶催化立體選擇性強，反應(yīng)條件溫和，操作簡便，成本低，且不會造成環(huán)境污染，從而利用酶催化法實現(xiàn)手性藥物的生物合成與拆分的發(fā)展前景良好。但如何制備得到相應(yīng)單一的酶，酶的回收以及如何使非水相拆分技術(shù)和超臨界流體技術(shù)能大規(guī)模地應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)依然是一個尚待解決的問題。相信隨著生物技術(shù)的進一步發(fā)展，酶催化法在手性藥物的合成與拆分上將得到更廣泛地應(yīng)用。

［1］ 秦勝利，于建生.手性藥物拆分技術(shù)進展[J].山東化工，2011，40（3）:51

［2］ 劉湘，方志杰，許建和，等.酵母細胞催化芳香酮的不對稱還原反應(yīng)[J].催化學報，2006，27（1）:20

［3］ JingK,Xu Z,Liu Y,et al.Efficient production ofrecombinant aldehyde reductase and in application for asymmetric reduction of ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate to ethyl（R）-4-chloro-3-hydroxy-butanoate[J].Prep BiochemBiotechnol,2005,35（3）:203

［4］ Rita M,Lasse G,Eyke C,et al.Practical applications ofhydrogenase I from Pyrococcus furiosus for NADPH generation and regeneration [J].Mol Catal B-Enzym,2003,24-25（1）:39

［5］ AsakoH,Itoh N,BannoK,et al.Purification and characterization of NADPH-dependent aldo-keto reductase specific for beta-keto esters from penicillium citrinum，and production of methyl（S）-4-bromo-3-hydroxybutyrate[J].Appl Microbiol Biotechnol,2004, 66（1）:53

［6］ Mustranta A.Use oflipases in the resolution ofracemic ibuprofen[J]. Appl Microbiol Biotechnol,1992,38（1）:61

［7］ Liu Y,Wang F,Tan T.Cyclic resolution of racemic ibuprofen via coupled efficient lipase and acid-base catalysis[J].Chirality,2009, 21（3）:349

［8］ Long Z D,Xu J H,Zhao L L,et al.Overexpression of Serratia marcescens lipase in Escherichia coli for efficient bioresolution of racemic ketoprofen[J].Mol Catal B-Enzym,2007,47（3）:105

［9］ Bae H A,Lee K W,Lee Y H.Enantiose1ective properties of extracellular lipase from Serratia marcescens ES-2for kinetic resolution of（S）-flurbiprofen[J].Mol Catal B-Enzym,2006,40（2）:24

［10］Neya S,ChangC K,OkunoD,et al.Control of iron（Ⅲ）spin-state in the model complexes of azide hemoprotein by porphycene,corrphycene,and hemiporphycene macrocycles[J].Inorg Chem,2005, 44（5）:1193

［11］Legros J,Dehli J R,Bolm C.Applications of catalytic asymmetric sulfide oxidations to the syntheses of biologically active sulfoxides [J].AdvSynth Catal,2005,347（1）:19

［12］Vargas R R,Marzorati L,WladislawB,et al.Asymmetric sulfoxidation of a beta-carbonyl sulfide series by chloroperoxidase[J].Tetrahedron Asymmetry,1999,10（16）:3219

［13］Purkarthofer T,Gruber-Khadjawi M,Skranc W,et al.Hydroxynitrile lyase-catalyzed enzymatic nitroaldol（Henry）reaction[J].Adv Synth Catal,2007,349:1443

［14］晁龍飛.生物催化拆分制備一種手性化合物 [J].新鄉(xiāng)醫(yī)學院學報,2009,26（4）:28

［15］徐剛,程詠梅,吳堅平,等.有機相酶催化拆分制備（S）-2-氯-1-（2-噻吩）-乙醇[J].有機化學,2007,27（7）:857

［16］Thayer A M.Enzymatic reactions combined with racemization can generate enantiopure materials in high yields[J].Chem Engi News, 2006,84（33）:29

［17］McConnell O,Bach A2nd,Balibar C,et a1.Enantiomericseparation and determination of absolute stereochemistry of asymmetric molecules in drugdiscovery:buildingchiral techno1ogytoolboxes[J]. Chirality,2007,19（9）:658

［18］Dunsmore C J,Carr R,Fleming T,et al.A chemo-enzymatic route toenantiomericallypure cyclic tertiaryamines[J].AmChemical Soc, 2006,128（7）:2224

［19］ComassetoJ V,Andrade L H,Omori A T,et al.Bioreduction of fluoroacetophenones by the fungi Aspergillus terreus and Rhizopus oryzae[J].Tetrahedron Asymmetry,2003,14（6）:711

［20］Zaks A,Klibanov A M.Enzymatic catalysis in nonaqueous solvents [J].Biol Chem,1998,263（7）:3194

［21］Gill I I,Das J,Patel R N.Enantioselective enzymatic acylation of 1-（3-bromophenyl）ethylamine[J].Tetrahedron Asymmetry,2007,18（11）:l330

［22］Liu H L,Anthonsen T.Enantiopure buildingblocks for chiral dugs from racemic mixtures of secondary alcohols by combination of lipase catalysis and mitsunobu esterification[J].Chirality,2002,14（1）:25

［23］尚雁，李娜，傅博詣，等.利用乳液酶膜反應(yīng)器拆分萘普生甲酯實驗研究[J].化學工程，2010，38（4）:50

［24］OngA,Kamaruddin A,Bhatia S,et al.Enantioseparation of（R,S）-ketoprofen using Candida antarctica lipase B in an enzymatic membrane reactor[J].High Resolu Chromatogr,2008,31（13）:2476

［25］Kawashima Y,York P.Drug delivery applications of supercritical fluid technology[J].AdvDrugDelivRev,2008,60（3）:297

［26］Gao L H,Chai S H,Cai Y F,et al.Solubility behavior of four diastereomeric salts and twoaminoacids in near-critical CO2[J].Acta PharmSin,2002,37（5）:355