周廣麒，呂晶，李忠海，李晶晶，王明鈺，曲音波，肖林，覃樹(shù)林，趙海濤，夏蕊蕊，方詡

1 大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034

2 山東大學(xué)微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100

3 山東大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012

4 山東龍力生物科技股份有限公司，山東 德州 251200

5 山東省秸稈生物煉制技術(shù)企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 德州 251200

木質(zhì)纖維素是自然界中分布最為廣泛的可再生資源。利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)潔凈的生物能源是將來(lái)解決石化產(chǎn)品污染的重要舉措。絲狀真菌能產(chǎn)生多種纖維素酶和半纖維素酶并有效降解木質(zhì)纖維素生成多用途糖類(lèi)。斜臥青霉Penicillium decumbens T.[1-3]作為重要的高產(chǎn)纖維素酶絲狀真菌之一，已應(yīng)用于纖維素酶及半纖維素酶的工業(yè)生產(chǎn)，但對(duì)于高效低成本地降解利用木質(zhì)纖維素，還需要對(duì)該菌株的多種代謝途徑進(jìn)行系統(tǒng)的菌株改造。

微生物細(xì)胞中，碳源代謝阻遏作為重要的生理代謝控制機(jī)制使細(xì)胞在較容易利用的碳源存在時(shí)，相比其他較難代謝的碳源具有優(yōu)先利用的特點(diǎn)。絲狀真菌中參與碳源代謝阻遏的蛋白主要有CREA (CRE1)[4]、CREB[5]、CREC[6]及CRED[7]。CREA 與釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae H.中的 Mig1/Mig2/Mig3蛋白同源[8]，為重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，介導(dǎo)葡萄糖在碳源代謝阻遏中的作用[9]，同時(shí)，CREA蛋白可與泛素結(jié)合，形成泛素化蛋白[7]。泛素化的CREA相對(duì)不穩(wěn)定，容易受到蛋白酶的降解。CREB和CREC分別編碼1個(gè)去泛素化蛋白酶[5]，在多核真核細(xì)胞中較為普遍，但在單核細(xì)胞釀酒酵母中未發(fā)現(xiàn)同源蛋白的存在。在構(gòu)巢曲霉Aspergillus nidulans W.中，creB基因編碼1個(gè)由767個(gè)氨基酸，包括6個(gè)去泛素化結(jié)構(gòu)域組成的去泛素化酶，屬于泛素特異性加工酶 (Ubiquitin-specific processing enzymes，UBP) 家族中的一員，其中的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域起到底物識(shí)別的作用[9]。CreB是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)參與碳代謝阻遏作用的去泛素化酶，CreB在第 240位、385位、473位和538位的氨基酸有4個(gè)重要的PEST序列，PEST序列是一段富含脯氨酸(P)、谷氨酰胺 (E)、絲氨酸 (S)、蘇氨酸 (T)，約由 10個(gè)氨基酸組成的結(jié)構(gòu)序列，被認(rèn)為是泛素化識(shí)別序列之一[10]。CreB的同源序列大部分存在比較高等的生物中，比如人類(lèi)的UBH1，擬南芥的UBP3，畢赤酵母Pichia pastoris Yeast C.中的UBP1以及黑腹果蠅的AAF56066。在構(gòu)巢曲霉中 CREB的缺失可以引起多種纖維素酶的產(chǎn)量提高[5]，Denton等在里氏木霉 Trichoderma reesei中敲除creB的同源序列cre2，同樣可以達(dá)到提高纖維素酶產(chǎn)量的作用[11]。CREB和CREC可形成去泛素化復(fù)合體，共同作用于泛素化的蛋白質(zhì)并使其去泛素化，從而使去泛素化的蛋白質(zhì)更為穩(wěn)定[6]。CRED包含1個(gè)抑制蛋白結(jié)構(gòu)域和1個(gè)PY模塊與釀酒酵母中的Rod1p和Rog3p蛋白具有高度的相似性，creD參與 1個(gè)與CREB-CREC復(fù)合物的去泛素化作用完全相反的過(guò)程，可以對(duì)靶蛋白進(jìn)行泛素化標(biāo)記[7]。由于蛋白質(zhì) (如 CREA) 泛素化水平的增高會(huì)造成該蛋白在細(xì)胞中受降解程度的變化，進(jìn)而影響到細(xì)胞利用碳源的代謝途徑，因此，CREB的缺失對(duì)真菌利用纖維素作為碳源分泌纖維素酶的影響值得深入研究。

通過(guò)敲除與構(gòu)巢曲霉creB基因同源的基因，獲得了該基因的突變株，研究CREB在斜臥青霉利用纖維素時(shí)對(duì)產(chǎn)纖維素酶的影響，對(duì)該突變株的表型，產(chǎn)纖維素酶及產(chǎn)胞外蛋白的能力進(jìn)行了測(cè)定和分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

斜臥青霉Ku-39 (Δpku70::hph)、菌株Kup-1 (Δpku70::hph；ΔpyrG::ptrA) 以及質(zhì)粒 pEKU由山東大學(xué)微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，pMD18-T載體購(gòu)自 TaKaRa公司，大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自TransGen Biotech公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

麩皮培養(yǎng)基：100 g麩皮加 1 L水，煮沸30 min，過(guò)濾后定容至1 L。固體麩皮培養(yǎng)基加2%瓊脂粉。LB培養(yǎng)基和測(cè)生物量液體培養(yǎng)基分別參照文獻(xiàn)[12]和[13]。表型分析培養(yǎng)基：Mandel′s營(yíng)養(yǎng)鹽液 (1倍)，1‰ Triton-100，2%瓊脂粉，碳源分別為2%葡萄糖，1%微晶纖維素，1%葡萄糖+1%微晶纖維素，2%可溶性淀粉，pH 5.5。測(cè)酶活培養(yǎng)基：Mandel′s 營(yíng)養(yǎng)鹽液(1倍)，1%微晶纖維素，pH 5.5。

1.1.3 主要試劑

Taq、FastPfu DNA 聚合酶購(gòu)自 TransGen Biotech公司、限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自Fermentas公司，瓊脂糖凝膠/PCR產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自 Biomiga公司，細(xì)胞壁裂解酶 (L1412-25G) 購(gòu)自 Sigma公司，改良型Bradford法蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，Southern雜交試劑盒購(gòu)自羅氏診斷產(chǎn)品 (上海)有限公司，pMD18-T載體購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 斜臥青霉分子生物學(xué)操作方法

質(zhì)粒提取：堿裂解法[12]，將帶有質(zhì)粒的大腸桿菌培養(yǎng)14 h，離心，倒掉上清液，加入溶液Ⅰ(GET) 充分懸浮菌體，再加入溶液Ⅱ (變性液)，加蓋顛倒6~7次充分混勻，加入溶液Ⅲ顛倒混合均勻后冰上放置 5 min，離心將上清液轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，利用醇沉的方法得到沉淀，用適量雙蒸水溶解。

真菌轉(zhuǎn)化：斜臥青霉Kup-1的轉(zhuǎn)化通過(guò)細(xì)胞壁裂解酶消化細(xì)胞壁得到原生質(zhì)體，再利用PEG-CaCl2法轉(zhuǎn)化目的DNA片段[13]。

染色體DNA提?。赫婢旧wDNA的提取采用液氮研磨法[13]。接種濃度為1×107個(gè)/mL新鮮的分生孢子于液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)48 h，將菌體過(guò)濾收集，放入研缽中加入液氮進(jìn)行研磨破碎，收集破碎后的菌體于15 mL離心管中加入適量抽提緩沖液，65 ℃水浴，然后加入苯酚/氯仿振蕩充分混合均勻后，離心收集上清液，加入NaAc和異丙醇，?20 ℃放置20 min后離心收集沉淀物，用70%乙醇，洗滌1次，待乙醇完全揮發(fā)后加入雙蒸水溶解。

1.2.2 轉(zhuǎn)化子表型分析

分別吸取1 μL濃度為1×105個(gè)/mL的孢子懸液，點(diǎn)接于表型分析培養(yǎng)基平板，30 ℃ 靜置培養(yǎng)9 d。

1.2.3 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

參考改良型 Bradford法蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明。

1.2.4 生物量測(cè)定

接 1×107個(gè)/mL分生孢子懸液 100 μL至50 mL液體基本培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min 培養(yǎng)，分別在24、33、42、51、60、69 h時(shí)取樣，真空過(guò)濾抽干，80 ℃烘干24 h，稱(chēng)重。

1.2.5 濾紙酶活、木聚糖酶活、內(nèi)切葡聚糖酶活、外切葡聚糖酶活力的測(cè)定

濾紙酶活：1 cm×6 cm定量濾紙條，1 mL醋酸緩沖液 (pH 4.8) 和0.5 mL稀釋后的粗酶液，50 ℃酶解1 h。

木聚糖酶活：1 mL 1%的燕麥木聚糖懸浮液，0.5 mL稀釋后的酶液，50 ℃酶解30 min。

內(nèi)切葡聚糖酶活：1 mL 1%的CMC-Na溶液，0.5 mL稀釋后的酶液，50 ℃酶解30 min。

以上3種酶活測(cè)定中，均以DNS法測(cè)定酶解液中的還原糖量。

外切葡聚糖酶活：0.5 mL稀釋后的粗酶液，加入50 μL pNPC (g/L)，50 ℃保溫30 min；加入150 μL 10% NaCO3終止反應(yīng)[14]。

酶活力單位：1分鐘內(nèi)水解底物產(chǎn)生1 μmol還原糖或?qū)ο趸椒铀璧拿噶慷x為1個(gè)酶活力單位 (IU)。

1.2.6 pH測(cè)定

取 1 mL產(chǎn)酶發(fā)酵液，12 000 r/min離心3 min，吸取上清液，測(cè)pH值。

1.2.7 ΔcreB::pyrG敲除盒的構(gòu)建

ΔcreB::pyrG 敲除盒的構(gòu)建 (圖 1)。ΔcreB::pyrG敲除盒上、下游同源臂 (5′-flanking，3′-flanking) 以及上游同源臂部分重復(fù)序列(5′-flanking RE) 的擴(kuò)增均以Ku-39染色體DNA為模板，分別以引物對(duì) CreB-uF+CreB-uR；CreB-dF+CreB-dR1和CreB-reF+CreB-reR為引物(表1)。pyrG篩選標(biāo)記表達(dá)盒的擴(kuò)增以質(zhì)粒pEKU (山東大學(xué)微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存) 為模板，PyrG-F1和PyrG-F2為引物。ΔcreB::pyrG敲除盒下游 3個(gè)片段的連接采用 Double-joint PCR[15]方法，融合 pyrG 篩選標(biāo)記表達(dá)盒、ΔcreB::pyrG敲除盒上游同源臂部分重復(fù)序列以及下游同源臂 3個(gè)片段，再以 PyrG-F2和CreB-dR2為嵌套引物，PCR擴(kuò)增獲得融合產(chǎn)物，并將該融合產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠純化回收后經(jīng)T/A連接插入到克隆載體pMD18-T上，獲得重組質(zhì)粒pCreB-DT，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。將質(zhì)粒pCreB-DT和ΔcreB::pyrG敲除盒上游同源臂分別進(jìn)行XbaⅠ和SmaⅠ雙酶切，然后通過(guò)T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒 pCreBqch，帶有上游部分同源臂序列的ΔcreB::pyrG 敲除盒構(gòu)建成功。將重組質(zhì)粒pCreBqch轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。以質(zhì)粒 pCreBqch為模板，CreB-uF和CreB-dR2為引物PCR大量擴(kuò)增ΔcreB::pyrG敲除盒，轉(zhuǎn)化斜臥青霉Kup-1原生質(zhì)體。

圖1 ΔcreB::pyrG敲除盒構(gòu)建流程圖Fig. 1 Flow diagram of ΔcreB::pyrG.

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primers used in this study

Double-joint PCR反應(yīng)體系：第1輪PCR， 50 μL反應(yīng)體系為：40 μL雙蒸水，上下游引物各1 μL，dNTPs (10 mmol) 1 μL，模板1 μL，10×緩沖液5 μL，Taq DNA聚合酶1 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃, 20 s；58 ℃, 30 s；72 ℃, 1 min 30 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。分別切膠回收3個(gè)第1輪PCR產(chǎn)物：上游同源臂、下游同源臂以及上游同源臂部分重復(fù)序列，來(lái)進(jìn)行第2輪PCR，本輪PCR不需要添加引物，反應(yīng)體系為：40 μL雙蒸水，dNTPs (10 mmol) 1 μL，3個(gè)DNA片段各1 μL，10×緩沖液5 μL，HIFI酶1 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃, 20 s； 55 ℃, 10 min；72 ℃, 4 min，12個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將第2輪PCR產(chǎn)物適當(dāng)稀釋作為第3輪PCR的模板；40 μL雙蒸水，dNTPs (10 mmol) 1 μL，10×緩沖液5 μL，HIFI酶1 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃, 20 s；55 ℃, 30 s；72 ℃, 5 min，32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

斜臥青霉creB基因序列已提交 GenBank，登錄號(hào)為JN977580。

1.2.8 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

根據(jù)斜臥青霉中 CreB氨基酸序列，自NCBI (National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)篩選出該蛋白在絲狀真菌中的同源序列。CreB同源序列分別來(lái)自產(chǎn)黃青霉Penicillium chrysogenum T.、構(gòu)巢曲霉A. nidulan、煙曲霉Aspergillus fumigates、黑曲霉Aspergillus niger、米曲霉 Aspergillus oryzae、Talaromyces stipitatus、馬爾尼菲青霉菌Penicillium marneffei、里氏木霉 T. reesei、粗糙脈孢菌 Neurospora crassa。鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) (Neighbor Joining tree)采用軟件包ClustalX 2.0和MEGA4.1分析構(gòu)建，標(biāo)尺為每位點(diǎn)氨基酸替代值。

2 結(jié)果與分析

2.1 ΔcreB::pyrG敲除盒的構(gòu)建

為得到 creB基因缺失突變株，首先構(gòu)建了ΔcreB::pyrG 敲除盒。首先，分別擴(kuò)增得到了ΔcreB::pyrG敲除盒上游同源臂序列1 476 bp、pyrG篩選標(biāo)記表達(dá)盒1 538 bp、ΔcreB::pyrG敲除盒上游同源臂部分重復(fù)序列 531 bp以及ΔcreB::pyrG敲除盒下游同源臂序列 1 733 bp (圖2泳道1–4)。采用Double-joint PCR[15]的方法將pyrG篩選標(biāo)記表達(dá)盒、ΔcreB::pyrG敲除盒上游同源臂部分重復(fù)序列以及ΔcreB::pyrG敲除盒下游同源臂，3個(gè)片段融合，嵌套引物PyrG-F2+ CreB-dR2擴(kuò)增得到3片段融合產(chǎn)物 (圖2泳道5)，然后將該融合片段連接到pMD18-T載體上，得到重組質(zhì)粒 pCreB-DT (圖 2泳道 6)。將質(zhì)粒pCreB-DT和 ΔcreB::pyrG敲除盒上游同源臂(圖2泳道6, 1) 分別進(jìn)行XbaⅠ和SmaⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)切膠回收后通過(guò) T4 DNA連接酶連接，得到重組質(zhì)粒 pCreBqch (圖 2泳道9)。以pCreBqch為模板，CreB-uF和CreB-dR2為引物擴(kuò)增ΔcreB::pyrG敲除盒 (圖2泳道13)。Hind Ⅲ和KpnⅠ分別單酶切驗(yàn)證ΔcreB::pyrG敲除盒，經(jīng)Hind Ⅲ酶切后電泳結(jié)果顯示得到3條帶大小分別為725 bp、1 185 bp以及2 819 bp (圖2泳道14)，KpnⅠ酶切后電泳結(jié)果顯示得到3條帶大小分別為482 bp、1 927 bp以及2 320 bp (圖2泳道15)，2個(gè)酶切結(jié)果均與預(yù)期目的條帶大小一致，表明ΔcreB::pyrG敲除盒構(gòu)建成功。

重組質(zhì)粒 pCreB-DT由華大基因進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

圖2 ΔcreB::pyrG敲除盒的構(gòu)建以及酶切驗(yàn)證Fig. 2 Construction of creB gene deletion cassette and the confirmation of the cassette structure by restriction enzyme digestion. 1: 5'-flanking region of creB gene in the deletion cassette; 2: pyrG; 3: Partial repeating sequence of the 5'-flanking region of creB gene in the deletion cassette; 4: 3'-flanking region of creB gene in the deletion cassette; 5: the fused cassette of 2,3,4 using nest PCR; 6: pCreB-DT vector; 7: amplification of the fused cassette of 2,3,4 using nest PCR from 6; 8: pCreB-DT vector digested with Hind Ⅲ; 9: pCreBqch; 10: colony PCR confirmation of pCreBqch; 11: 10 digested by EcoR I; 12: 10 digested by Kpn I; 13: the creB gene deletion cassette; 14: 13 digested by Hind III; 15: 13 digested by Kpn I.

2.2 ΔcreB突變株的構(gòu)建

將構(gòu)建成功的 ΔcreB::pyrG 敲除盒轉(zhuǎn)入Kup-1菌株中。在轉(zhuǎn)化平板上獲取轉(zhuǎn)化子10~15個(gè)/μg DNA。為排除轉(zhuǎn)化子中的異核體，挑取轉(zhuǎn)化子在平板上經(jīng)過(guò)2輪劃線(xiàn)分單孢復(fù)篩培養(yǎng)。將純化后的轉(zhuǎn)化子接入到基本培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng) 48 h。提取轉(zhuǎn)化子基因組DNA。以提取的基因組 DNA為模板，PyrG-F2和PyrG-R為引物擴(kuò)增pyrG表達(dá)盒部分序列，(圖3，泳道1–2)，擴(kuò)增出大小為1 345 bp的目的條帶，表明 ΔcreB::pyrG敲除盒已成功轉(zhuǎn)入到出發(fā)菌株中。CreB-YZF1和CreB-YZR1 (序列見(jiàn)表 1) 為引物，其中引物 CreB-YZF1和CreB-YZR1結(jié)合位點(diǎn)分別位于ΔcreB::pyrG敲除盒上游同源臂和下游同源臂，分別以出發(fā)菌株及轉(zhuǎn)化子基因組DNA為模板，出發(fā)菌株擴(kuò)增獲得3 573 bp大小目的條帶 (圖3，泳道3)，而轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增出片段大小為 2 652 bp大小目的條帶(圖 3，泳道 4–5)，表明 ΔcreB::pyrG敲除盒在creB基因位點(diǎn)發(fā)生同源雙交換，creB基因編碼區(qū)已被置換；為進(jìn)一步驗(yàn)證creB基因已被同源敲除，以PyrG-YF和CreB-dR1為引物，分別以出發(fā)菌株及2株不同轉(zhuǎn)化子基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中引物PyrG-YF和CreB-dR1的結(jié)合位點(diǎn)分別位于 pyrG基因編碼區(qū)和ΔcreB::pyrG 敲除盒下游同源臂外側(cè)的染色體上。由于出發(fā)菌株不能擴(kuò)增出相應(yīng)大小的目的條帶 (圖3，泳道6)，而以2株轉(zhuǎn)化子DNA為模板，上下游引物可配對(duì)擴(kuò)增出大小為2 515 bp的目的條帶 (圖3，泳道7–8) 說(shuō)明2株轉(zhuǎn)化子發(fā)生同源雙交換。以上結(jié)果表明，ΔcreB突變株已構(gòu)建成功。

2.3 ΔcreB突變株的Southern blotting分析

圖3 ΔcreB轉(zhuǎn)化子的PCR驗(yàn)證Fig. 3 Verification of transformants by PCR analysis. 1–2: amplification of pyrG gene with genomic DNA of the transformants; 4–5, 7–8: amplification was performed with genomic DNA of the primary transormants; 3, 6: amplification was performed with genomic DNA of ΔpyrG::ptrA.

為分析ΔcreB::pyrG敲除盒在轉(zhuǎn)化子染色體中的整合類(lèi)型，對(duì)得到的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行 Southern blotting (圖 4A) 檢測(cè)，首先分別提取出發(fā)菌株Kup-1及 ΔcreB::pyrG 敲除盒轉(zhuǎn)化子基因組DNA，然后經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶 BamHⅠ酶切，ΔcreB::pyrG敲除盒下游同源臂 DNA片段為探針進(jìn)行 Southern雜交 (圖 4B)。雜交結(jié)果顯示ΔcreB突變株出現(xiàn)單1條帶 (圖4A，泳道1)，該條帶大小符合 ΔcreB::pyrG敲除盒在 creB位點(diǎn)以同源雙交換整合方式所產(chǎn)生雜交片段的大小，并未出現(xiàn)出發(fā)菌株雜交所示條帶 (圖 4A WT)。由于ΔcreB突變株未出現(xiàn)因敲除盒的隨機(jī)插入而產(chǎn)生的條帶，因此，雜交結(jié)果表明ΔcreB::pyrG敲除盒是以單拷貝的形式整合到轉(zhuǎn)化子染色體上。

2.4 ΔcreB突變株的表型分析

為分析creB基因缺失對(duì)該菌株表型的影響，吸取ΔcreB突變株及菌株Ku-39分生孢子懸液，分別點(diǎn)接于葡萄糖、微晶纖維素、葡萄糖+微晶纖維素以及可溶性淀粉為碳源的平板。在以葡萄糖為唯一碳源的基本培養(yǎng)基上，ΔcreB突變株的菌落形態(tài)以及生長(zhǎng)速率相比菌株 Ku-39均未發(fā)生明顯變化 (圖5A)，表明creB基因的缺失對(duì)菌株的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)未產(chǎn)生明顯的影響。在以可溶性淀粉為唯一碳源的平板上，ΔcreB突變株的菌落生長(zhǎng)表型相比Ku-39菌株也無(wú)明顯變化，但平板經(jīng)碘化鉀染色后 (圖 5D)，突變株所形成的淀粉水解圈變大，表明ΔcreB突變株分泌淀粉酶的活性增強(qiáng)。在以微晶纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基上(圖5B)，ΔcreB突變株生長(zhǎng)正常，與對(duì)照菌株相比無(wú)明顯差異，但在菌株ΔcreB菌落周?chē)霈F(xiàn)明顯的因纖維素降解所形成的透明圈，而菌株Ku-39菌落周?chē)闯霈F(xiàn)纖維素水解透明圈，表明creB基因的缺失可提高突變株產(chǎn)纖維素酶的活性，特別在葡萄糖存在的培養(yǎng)條件下，以微晶纖維素+葡萄糖為復(fù)合碳源的培養(yǎng)基上 (圖 5C)，ΔcreB突變株仍能形成較為明顯的纖維素水解透明圈，表明 creB基因的缺失不僅能提高產(chǎn)纖維素酶的能力，而且還呈現(xiàn)出一定的抗葡萄糖代謝阻遏效應(yīng)。

圖4 斜臥青霉Kup-1 creB敲除Southern blotting分析Fig. 4 Southern blotting analysis of the P. decumbens Kup-1 ΔcreB knockout strain. (A) Southern blotting analysis of the knockout strain. M: 1 kb ladder. WT: Southern blotting of genomic DNA extracted from wild-type. 1: Southern blotting of genomic DNA extracted from the knockout strain. (B) Diagram of creB deletion by homologous recombination.

圖5 ΔcreB突變株的平板檢測(cè)分析Fig. 5 Comparing the morphologies of ΔcreB and the Ku-39 strain cultivated for 9 days. (A) Glucose. (B) Cellulose. (C) Glucose +Cellulose. (D) Starch.

2.5 pH值的變化

為測(cè)定 CREB的缺失對(duì)菌株在液體培養(yǎng)條件下發(fā)酵的影響，對(duì)菌株Ku-39和ΔcreB突變株不同培養(yǎng)時(shí)間段發(fā)酵液的 pH值進(jìn)行了測(cè)定(圖6)。ΔcreB突變株和Ku-39菌株發(fā)酵液的pH值在48 h內(nèi)均明顯處于下降的狀態(tài)，在24 h處，ΔcreB突變株發(fā)酵液的pH值下降速度明顯慢于出發(fā)菌株。Ku-39菌株和ΔcreB突變株發(fā)酵液的pH值48 h前后分別達(dá)到最低點(diǎn)3.6和3.5，并在48 h與120 h之間發(fā)酵液pH值穩(wěn)步上升達(dá)到5.2左右，隨后 pH值趨于穩(wěn)定，結(jié)果表明，CREB的缺失對(duì)突變株在以微晶纖維素為唯一碳源的發(fā)酵液pH值沒(méi)有明顯變化。

圖6 菌株Ku-39和ΔcreB突變株發(fā)酵過(guò)程的pH值Fig. 6 pH value of P. decumbens Ku-39 and ΔcreB.

2.6 酶活力的變化

在液體培養(yǎng)產(chǎn)酶條件下，對(duì)菌株 Ku-39和ΔcreB突變株不同培養(yǎng)時(shí)間段發(fā)酵液的濾紙酶活、內(nèi)切葡聚糖酶活、木聚糖酶活、外切葡聚糖酶活進(jìn)行了測(cè)定 (圖7)。ΔcreB突變株發(fā)酵液的濾紙酶活、內(nèi)切葡聚糖酶活、木聚糖酶活、外切葡聚糖酶活均比出發(fā)菌株的相應(yīng)酶活顯著提高，其中，ΔcreB突變株發(fā)酵液的濾紙酶活在第144 h時(shí)，比Ku-39菌株發(fā)酵液提高了1.8倍 (圖7A)，內(nèi)切葡聚糖酶活在96 h比出發(fā)菌株提高1.71倍(圖 7B)，木聚糖酶活在 120 h時(shí)提高 2.06倍(圖7C)，外切葡聚糖酶活在96 h時(shí)提高2.04倍(圖7D)。ΔcreB突變株纖維素酶活的提高與在固體纖維素平板上該突變株的表型一致，均表現(xiàn)出纖維素酶分泌活性的顯著增加，由此表明，CREB的缺失可顯著增強(qiáng)突變株產(chǎn)纖維素酶的能力，進(jìn)而提高菌株降解利用纖維素的效能。

2.7 分泌蛋白質(zhì)總量變化

圖7 菌株Ku-39和ΔcreB突變株的濾紙酶活、內(nèi)切葡聚糖酶活、木聚糖酶活、外切葡聚糖酶活Fig. 7 Filter paper activity, endoglucanase activity, xylanase activity and exoglucanase activity by P. decumbens Ku-39 and ΔcreB. (A) Production of filter paper activity by P. decumbens Ku-39 and ΔcreB. (B) Production of endoglucanase activity by P. decumbens Ku-39 and ΔcreB. (C) Production of xylanase activity by P. decumbens Ku-39 and ΔcreB. (D) Production of exoglucanase activity by P. decumbens Ku-39 and ΔcreB.

圖8 菌株Ku-39和ΔcreB突變株的分泌蛋白質(zhì)含量Fig. 8 Concentration of secreted protein of P. decumbens Ku-39 and ΔcreB during the fermentation.

在液體培養(yǎng)產(chǎn)酶條件下，對(duì)菌株 Ku-39和ΔcreB突變株不同培養(yǎng)時(shí)間段發(fā)酵上清液蛋白質(zhì)含量進(jìn)行了測(cè)定 (圖8)。在培養(yǎng)至24 h時(shí)，ΔcreB突變株與菌株 Ku-39發(fā)酵液的蛋白質(zhì)含量均比較低，自培養(yǎng)24 h開(kāi)始，ΔcreB突變株發(fā)酵上清液中的蛋白質(zhì)含量相比對(duì)照菌株明顯提高，其中在72 h、96 h、120 h、144 h以及168 h時(shí)，其蛋白質(zhì)含量分別達(dá)到菌株 Ku-39的 1.93倍、2.68倍、2.00倍、2.30倍以及1.31倍，胞外蛋白質(zhì)濃度總體呈明顯的上升趨勢(shì)。因此，creB基因的缺失可導(dǎo)致細(xì)胞外蛋白質(zhì)含量的顯著增加。

2.8 生物量變化

為測(cè)定 creB基因的缺失是否影響菌株的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，接濃度為1×107個(gè)/mL的分生孢子到液體基本培養(yǎng)基中。ΔcreB突變株和菌株Ku-39在培養(yǎng)24 h后，進(jìn)入了對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并且在48 h左右達(dá)到菌體的最大量。在培養(yǎng)48 h后，ΔcreB突變株生物量進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定的平臺(tái)期，生物量相比菌株Ku-39略低。在液體培養(yǎng)條件下，creB 基因的缺失可輕度影響突變株的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng) (圖9)。

圖9 菌株Ku-39和ΔcreB突變株的生長(zhǎng)量Fig. 9 Growth of P. decumbens Ku-39 and ΔcreB in glucose-based medium.

2.9 CREB在絲狀真菌中的系統(tǒng)進(jìn)化

從CreB系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) (圖10) 可以發(fā)現(xiàn)，CreB存在于許多產(chǎn)纖維素酶絲狀真菌中，并且其氨基酸序列與產(chǎn)黃青霉以及曲霉屬來(lái)源的CreB同源序列有較高的相似度。因此可以推測(cè)CreB在絲狀真菌纖維素酶合成過(guò)程中具有重要的作用。

圖10 CreB系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 10 The neighbor joining tree of CreB. Deubiquitinating enzyme CreB are highly conserved across most sequenced filamentous fungi. The neighbor joining tree above shows the phylogenetic relationship of some of the fungal CreB in the NCBI protein database and their relationship to P. decumbens CreB. The bootstrap values are shown and the The bar=0.05 represents genetic distance in substitutions per amino acid.

3 討論

通過(guò)同源雙交換整合的方式在斜臥青霉中敲除 creB基因，獲得了產(chǎn)纖維素酶和胞外蛋白質(zhì)含量均提高的突變株ΔcreB。creB基因編碼1種去蛋白質(zhì)泛素化酶[5]，因此，開(kāi)展微生物蛋白質(zhì)的泛素化與去泛素化的研究對(duì)于菌株的改造具有重要的意義。

真菌遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中可利用的篩選標(biāo)記比較有限。現(xiàn)在較為常用的篩選標(biāo)記主要有ptra[16]、hph[17]、Hyg[18]、pyrG[19]和amdS[20]等，但工業(yè)菌株的系統(tǒng)改造需要在同一株菌中進(jìn)行多次的遺傳操作，因此，需要在斜臥青霉中通過(guò)構(gòu)建可重復(fù)利用的篩選標(biāo)記操作系統(tǒng)，用于該菌累積式的系統(tǒng)改造。在斜臥青霉中已經(jīng)構(gòu)建了高效的遺傳基因打靶系統(tǒng)菌株Ku-39[21]，并在此基礎(chǔ)上獲取了 pyrG缺失突變株 Kup-1 (數(shù)據(jù)未發(fā)表)。在構(gòu)建creB敲除盒的過(guò)程中，在該敲除盒的pyrG表達(dá)盒兩側(cè)加入同源臂部分重復(fù)序列。由于該菌株具有高效的同源重組效率，因此，在含有 5′-氟乳清酸 (5′-FOA) 的平板上可高效篩選pyrG篩選標(biāo)記自我剪切的菌株。篩選標(biāo)記重復(fù)利用系統(tǒng)的建立為該菌株代謝途徑的優(yōu)化重組，進(jìn)而為構(gòu)建高產(chǎn)纖維素酶菌株提供了良好的基因操作基礎(chǔ)。

蛋白質(zhì)的泛素化可導(dǎo)致蛋白質(zhì)的降解和影響蛋白質(zhì)的活性。ΔcreB突變株也可在含有葡萄糖的纖維素平板上形成透明圈，表明該突變株在葡萄糖存在的情況下仍有較強(qiáng)的纖維素酶活性。在絲狀真菌降解利用纖維素等過(guò)程中，如存在較容易利用的碳源，則可抑制纖維素酶的產(chǎn)生，從而產(chǎn)生碳源代謝阻遏效應(yīng)。負(fù)責(zé)碳源代謝阻遏的蛋白主要有 CREA[4]、CREB[5]、CREC[6]及CRED[7]。CREA作為1種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可通過(guò)影響其他調(diào)控因子如 XlnR[22-23]，間接調(diào)控木聚糖的利用，并且，CREA的缺失可造成明顯的抗代謝物阻遏作用。CREB和CREC分別編碼1種去蛋白質(zhì)泛素化的蛋白，這2種蛋白的結(jié)合可形成具有去蛋白質(zhì)泛素化功能的復(fù)合物[6]，該復(fù)合物可與泛素化后的 CREA相結(jié)合并使其去泛素化，進(jìn)而增強(qiáng)CREA的穩(wěn)定性，而CREB的缺失則造成CREC和CREB不能形成有效的去泛素化復(fù)合物，從而導(dǎo)致泛素化后的CREA蛋白不穩(wěn)定，容易受到蛋白酶的降解，進(jìn)而減少葡萄糖代謝的阻遏效應(yīng)，同樣，在缺失CREC蛋白的情況下，也可產(chǎn)生與 CREB缺失相類(lèi)似的現(xiàn)象(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。因此，開(kāi)展對(duì)蛋白質(zhì)的降解機(jī)理的研究對(duì)于提高菌株蛋白質(zhì)的產(chǎn)量，特別是針對(duì)菌株高產(chǎn)工業(yè)用酶的研究具有較強(qiáng)的指導(dǎo)作用。

碳源代謝阻遏調(diào)控機(jī)制的存在，使細(xì)胞能優(yōu)先利用營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的碳源作為細(xì)胞的能源，特別是在葡萄糖等較易利用碳源存在條件下，可顯著降低纖維素酶的產(chǎn)量。絲狀真菌中纖維素酶的表達(dá)轉(zhuǎn)錄明顯受轉(zhuǎn)錄因子 CREA/CRE1[24-26]、XLNR/XYR1[27-29]、ACE1、ACE2[24]等的調(diào)控，其中CREA/CRE1是細(xì)胞產(chǎn)生碳源代謝阻遏過(guò)程中特別重要的調(diào)控中間體。在里氏木霉[25]、斜臥青霉[13]等絲狀真菌中，CREA/CRE1的缺失造成纖維素酶表達(dá)過(guò)程中碳源代謝阻遏現(xiàn)象的降低或消除，并使相應(yīng)突變株中纖維素酶表達(dá)量明顯提高。里氏木霉中，XYR1和ACE1分別作為纖維素酶表達(dá)重要的正向和負(fù)向轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，CRE1的完全缺失明顯降低XYR1的轉(zhuǎn)錄活性，并且導(dǎo)致ACE1的表達(dá)顯著提高，表明ACE1也受到了明顯的碳源代謝阻遏效應(yīng)[25]。里氏木霉中ACE2可正向調(diào)控纖維素酶的表達(dá)。CRE1蛋白的完全缺失可導(dǎo)致ACE2表達(dá)量顯著降低[25]，然而在構(gòu)巢曲霉、斜臥青霉和黑曲霉中，未發(fā)現(xiàn)與ACE2同源的調(diào)控蛋白，表明絲狀真菌纖維素酶系的表達(dá)調(diào)控存在較大區(qū)別。由于CREA/CRE1的穩(wěn)定性受細(xì)胞蛋白質(zhì)泛素化/去泛素化機(jī)制的明顯影響，因此，深入研究絲狀真菌重要蛋白質(zhì)泛素化的機(jī)制對(duì)于消除或降低纖維素酶表達(dá)的碳源代謝阻遏效應(yīng)有重要的作用。

提高絲狀真菌產(chǎn)纖維素酶的活性一直是重要的研究領(lǐng)域。通過(guò)缺失去蛋白質(zhì)泛素化蛋白CREB，獲得產(chǎn)纖維素酶活性提高的ΔcreB突變株，該突變株不僅能顯著提高菌株的濾紙酶活，而且對(duì)纖維素內(nèi)切酶、外切酶、木聚糖酶活均有明顯的提高作用，表明CREB很可能也作用于其他 (除CREA之外) 與纖維素酶基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，并影響到其穩(wěn)定性。而且，通過(guò)圖 10的 CreB系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)斜臥青霉CreB與產(chǎn)黃青霉以及曲霉屬的較為相近。在產(chǎn)纖維素酶絲狀真菌中，纖維素酶的調(diào)控受到多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的作用，如 ACE1[30]、ACE2[30]、CREA[4]、XLNR[22-23]以及其他新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 (數(shù)據(jù)未發(fā)表)，因此，對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子穩(wěn)定性的改造作為1種重要的細(xì)胞調(diào)控機(jī)制對(duì)于產(chǎn)酶菌株生產(chǎn)改造具有重要的意義。

由于絲狀真菌具有較強(qiáng)的蛋白分泌能力，已成為重要的表達(dá)生產(chǎn)內(nèi)、外源蛋白“細(xì)胞工廠(chǎng)”之一。然而由于絲狀真菌較強(qiáng)的蛋白酶活性，表達(dá)分泌到細(xì)胞外的外源蛋白產(chǎn)量仍處于較低水平。CREB的缺失可使突變株分泌胞外蛋白的含量提高2.68倍。細(xì)胞外蛋白質(zhì)含量的增加，有可能由于 creB基因的缺失造成蛋白酶的泛素化，進(jìn)而造成泛素化的蛋白酶的快速降解，從而間接提高了蛋白分泌到細(xì)胞外的含量。因此，深入開(kāi)展蛋白質(zhì)的改造對(duì)于提高內(nèi)、外源蛋白的高效表達(dá)并提高其穩(wěn)定性具有重要的作用。

通過(guò)同源雙交換整合的方式首次在青霉中敲除了編碼去蛋白質(zhì)泛素化的基因creB，該基因的敲除未對(duì)菌株的表型產(chǎn)生明顯的影響，但可顯著提高突變株的纖維素降解利用能力，并且明顯增加胞外蛋白質(zhì)的含量。斜臥青霉作為重要的產(chǎn)纖維素酶工業(yè)生產(chǎn)菌株，其基因組序列已測(cè)序完成，因此，利用基因工程手段并結(jié)合組學(xué)的研究方法對(duì)菌株的代謝途徑進(jìn)行系統(tǒng)改造已成為構(gòu)建高效工業(yè)生產(chǎn)菌株重要的創(chuàng)造平臺(tái)。

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