郭延濤，沈紹傳，贠軍賢，姚克儉

浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程與材料學(xué)院 綠色合成技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 杭州 310032

質(zhì)粒DNA (pDNA) 可作為DNA載體用于基因治療。相比于病毒載體來說，作為非病毒的pDNA安全方便[1]。近幾年，基因治療和 DNA疫苗技術(shù)的快速發(fā)展推動了對 pDNA載體的大量需求[2]，至2011年，全球開展的1 714項(xiàng)基因治療臨床醫(yī)學(xué)試驗(yàn)中，有 18.7% (320項(xiàng)) 是以超螺旋質(zhì)粒 DNA (scpDNA) 為外源基因運(yùn)載載體[3]。獲得pDNA一般要經(jīng)過質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、菌體培養(yǎng)擴(kuò)增質(zhì)粒、菌體裂解和分離純化等幾個步驟。從工程菌裂解液中分離 pDNA的實(shí)驗(yàn)室方法有些要用到動物源性酶，如煮沸法要用的溶菌酶和RNA酶，有些要用到有毒試劑，如堿裂解法要用苯酚和氯仿，溴化乙錠-氯化銫密度梯度離心法要用溴化乙錠和氯化銫，不適于藥用pDNA的大規(guī)模制備。柱層析是生物分離中應(yīng)用最廣泛的方法之一，層析介質(zhì)是其關(guān)鍵。針對蛋白質(zhì)或酶等生物分子吸附分離而設(shè)計的常規(guī)商業(yè)化介質(zhì)，孔徑在納米量級范圍，適于分子量較小的目標(biāo)物的擴(kuò)散吸附。但是，對于pDNA等生物大分子物質(zhì)，難以在這些介質(zhì)內(nèi)部擴(kuò)散吸附，吸附容量和分離效率低。因此，研究適于pDNA等生物大分子的層析新技術(shù)和新介質(zhì)，具有重要意義。近些年來，依據(jù)pDNA的各種特性，研究人員提出了不同的層析分離純化方法，如離子交換色譜法[4-5]、疏水作用色譜法[6-7]、尺寸排阻色譜法[8]等。

超大孔連續(xù)床晶膠是一種新型的分離介質(zhì)，內(nèi)部有幾微米至上百微米的相互連通的超大孔隙，可實(shí)現(xiàn)生物大分子的快速分離純化[9-16]。離子交換型晶膠介質(zhì)因其具有良好的選擇性、傳質(zhì)阻力小和吸附分離迅速等優(yōu)點(diǎn)，在分離純化生物大分子的應(yīng)用中受到廣泛關(guān)注[5,9,12,14-16]。Wang等制得經(jīng)二乙氨基乙基葡聚糖 (DEAE-Dextran)改性的弱陰離子交換聚甲基丙烯酸酯基連續(xù)床,并應(yīng)用于蛋白混合物的分離[17]。本研究中，通過溶劑結(jié)晶致孔法制備聚丙烯酰胺基晶膠基質(zhì)，然后接枝DEAE-Dextran得到陰離子交換型晶膠介質(zhì)。用該晶膠介質(zhì)從大腸桿菌Escherichia coli裂解液中分離pDNA。分離過程中未加入動物源性酶，也沒有加入苯酚、氯仿和溴化乙錠等有毒試劑，使操作過程以及獲得的pDNA產(chǎn)物更加安全。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

DEAE-Dextran (相對分子質(zhì)量500 000)、烯丙基縮水甘油醚 (AGE) 和 N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺 (MBAAm) 購自 Sigma-Aldrich公司 (美國)；丙烯酰胺 (AAm)、考馬斯亮藍(lán)G-250和瓊脂糖購自 Biobasic公司 (加拿大)；質(zhì)粒 pUC19購自Fermentas公司 (加拿大)；E. coli DH5α菌株、過硫酸銨 (APS)、LB培養(yǎng)基、N,N,N',N'-四甲基乙二胺 (TEMED)、十二烷基硫酸鈉 (SDS)和乙二胺四乙酸 (EDTA) 購自生工生物工程(上海) 有限公司；其余試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器

BT1-100E恒流泵、HD-21-88紫外檢測儀 (上海琪特分析儀器有限公司)，Sub-Cell GT system核酸電泳儀 (Bio-Rad，美國)，Tanon-3500全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng) (上海天能科技有限公司)，THCD-01低溫恒溫槽 (寧波天恒儀器廠)，Ultrospec 3300 pro紫外/可見光分光光度計 (GE Healthcare)。

1.2 方法

1.2.1 晶膠基質(zhì)的制備

將單體AAm、配基AGE和交聯(lián)劑MBAAm配成反應(yīng)液，在直徑為10 mm的玻璃層析柱內(nèi)，變溫冷凍條件下聚合獲得晶膠基質(zhì)，具體方法見文獻(xiàn)[18]。AAm、AGE和MBAAm的總質(zhì)量濃度為7%，其中AAm與AGE質(zhì)量比為10/1，(AAm+AGE) 和MBAAm質(zhì)量比為10/1，引發(fā)劑APS占AAm、AGE和MBAAm總質(zhì)量的1.2%，加速劑TEMED占AAm、AGE和MBAAm總質(zhì)量的0.5%。具體變溫過程見文獻(xiàn)[19]中的冷凍曲線B。

1.2.2 陰離子交換基團(tuán)的接枝

將DEAE-Dextran溶于0.025 mol/L Na2HPO4-NaOH緩沖液 (pH 12) 中，配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的溶液。先用恒流泵將 DEAE-Dextran溶液以1.6 mL/min的速度泵過晶膠基質(zhì)至pH值恒定，然后在室溫下，以0.4 mL/min的速度密封循環(huán)反應(yīng)48 h。反應(yīng)機(jī)理見文獻(xiàn)[17]。

1.2.3 陰離子交換晶膠介質(zhì)的性能測試

陰離子交換晶膠介質(zhì)的性能測試方法見文獻(xiàn)[18-19]。通過脈沖示蹤法以3% (V/V) 丙酮為示蹤劑獲得停留時間分布 (RTD) 曲線，根據(jù)相應(yīng)公式計算得到理論塔板數(shù)和理論塔板高度(HETP)。通過測定單位時間內(nèi)流經(jīng)晶膠介質(zhì)的水流量和對應(yīng)的水力壓降，利用達(dá)西方程計算得到滲透率。以牛血清白蛋白為模型蛋白考察層析性能。通過掃描電鏡觀察孔隙結(jié)構(gòu)。

1.2.4 pDNA的擴(kuò)增及初步處理

E. coli DH5α用LB液體培養(yǎng)基在37 ℃、150 r/min下進(jìn)行培養(yǎng)。菌體培養(yǎng)至OD600達(dá)0.5左右，進(jìn)行質(zhì)粒 pUC19轉(zhuǎn)化，經(jīng)含氨芐青霉素(Amp) 平板篩選后，在含有0.1 mg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中再培養(yǎng)，在OD600達(dá)到2.0時收集菌體。采用比較常用的堿法進(jìn)行裂解，具體步驟如下：1) 150 mL經(jīng)pDNA轉(zhuǎn)化的E. coli DH5α培養(yǎng)液，室溫下12 000 r/min離心5 min，收集菌體；2) 將菌體重懸于 10 mL預(yù)冷的溶液Ⅰ(50 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L EDTA，25 mmol/L Tris-HCl，pH 8) 中，劇烈振蕩，室溫放置3 min；3) 加入 20 mL新鮮配制的溶液Ⅱ (0.2 mol/L NaOH，1% SDS)，顛倒數(shù)次混勻，冰上靜置3 min；4) 加入15 mL預(yù)冷的溶液Ⅲ (3 mol/L乙酸鉀，2 mol/L乙酸，pH 4.8)，將離心管溫和顛倒數(shù)次混勻，冰上靜置20 min后，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，所得的上清液用于層析。

1.2.5 陰離子交換晶膠介質(zhì)層析分離pDNA

陰離子交換晶膠層析分離 pDNA的過程如下：1) 用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液 (PB) 平衡晶膠床柱；2) 將1.2.4中所得的上清液用PB稀釋至5倍作為層析上樣液，以1.6 mL/min上樣至吸附飽和，然后用PB進(jìn)行沖洗以除去游離在晶膠介質(zhì)中的雜質(zhì)；3) 分別用不同濃度的NaCl溶液(用PB配制) 依次洗脫；4) 用0.5 mol/L NaOH和大量的去離子水對晶膠介質(zhì)進(jìn)行再生。整個層析過程在波長為254 nm的紫外檢測儀下檢測并記錄，在上樣和沖洗階段每60 s收集1管，在洗脫階段每30 s收集1管。

1.2.6 分析方法

選取層析過程代表性樣品用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，電壓80 V。0.05 mg/L溴化乙錠染色20 min后用Tanon-3500全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)在紫外燈下進(jìn)行觀察和圖像拍攝。用Quantity One (v 4.6.2) 軟件對pDNA的純度和含量進(jìn)行分析。洗脫液中的蛋白含量用考馬斯亮藍(lán)染色法測定[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 陰離子交換晶膠介質(zhì)的基本性能

陰離子交換晶膠介質(zhì)直徑為10 mm，長度為7.5 cm。用脈沖示蹤法所測得的該晶膠介質(zhì)的RTD曲線如圖1所示。由圖可知，表觀流速 (UL)從1 cm/min到12 cm/min范圍內(nèi)，RTD峰型對稱性較好。根據(jù) RTD數(shù)據(jù)計算得到晶膠介質(zhì)的HETP，如圖 2所示。晶膠介質(zhì)的 HETP在0.069 cm到0.076 cm之間，說明此晶膠介質(zhì)的傳質(zhì)分離性能較好。晶膠介質(zhì)的壓降與流速的關(guān)系如圖 3所示，根據(jù)達(dá)西公式計算得到滲透率為2.03×10?12m2，流體流動阻力較小。晶膠介質(zhì)對牛血清白蛋白的吸附容量達(dá)到1.1 g/L晶膠介質(zhì)。通過掃描電鏡觀察到的晶膠孔隙結(jié)構(gòu)如圖 4所示，由圖可知晶膠介質(zhì)的孔隙結(jié)構(gòu)較均勻，且連通性較好。因此，該陰離子交換型晶膠介質(zhì)性能較好，適用于pDNA的層析分離。

2.2 pDNA的層析分離

圖1 陰離子交換晶膠介質(zhì)的RTDsFig. 1 Residence time distributions at various liquid velocities in the anion-exchange cryogel.

圖2 陰離子交換晶膠介質(zhì)的HETPFig. 2 Variation of height equivalent to theoretical plate with liquid velocity in the anion-exchange cryogel.

圖3 陰離子交換晶膠介質(zhì)壓降與流速的關(guān)系Fig. 3 Flow rate vs. pressure drop in the anionexchange cryogel.

圖4 陰離子交換晶膠介質(zhì)孔隙結(jié)構(gòu)的掃描電鏡圖片F(xiàn)ig. 4 Scanning electron microscope photograph of the anion-exchange cryogel.

通過在堿性條件下使晶膠基質(zhì)上的環(huán)氧基團(tuán)開環(huán)后接枝陰離子交換基團(tuán) DEAE-Dextran。由于DEAE-Dextran是長鏈聚合物，吸附位點(diǎn)多，如觸手一樣長在晶膠孔隙表面，可靈活地延伸到孔內(nèi)料液流體中，有利于較大尺寸的pDNA的吸附，使晶膠介質(zhì)有較大的吸附容量和較高的選擇性。pDNA有scpDNA、開環(huán)pDNA (ocpDNA) 和線性pDNA (lnpDNA) 三種構(gòu)型，其中scpDNA是有效的DNA載體[21]，電泳遷移速率scpDNA大于lnpDNA和ocpDNA。E. coli經(jīng)過溶液Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ處理后，細(xì)胞被裂解，大部分蛋白被沉淀，經(jīng)離心后，上清液中除了目標(biāo)物scpDNA外，還含有基因組DNA (gDNA)、lnpDNA、ocpDNA、RNA、少量蛋白和細(xì)胞碎片等雜質(zhì)，細(xì)胞碎片可直接通過晶膠介質(zhì)流出，其他雜質(zhì)均可能被吸附，需要優(yōu)化層析條件以得到高純度的scpDNA。

在pH 7.2下進(jìn)行層析，分別用0.3、0.35、 0.4或0.5 mol/L NaCl進(jìn)行第一步洗脫，用1 mol/L NaCl進(jìn)行第二步洗脫。洗脫的scpDNA中均含有較多雜質(zhì)，梯度洗脫沒有將scpDNA與雜質(zhì)分開。在pH 6.0、6.6或7.8條件下分別進(jìn)行層析，發(fā)現(xiàn)在pH 6.0和7.8條件下層析得到的scpDNA均含有較多雜質(zhì)，只有在pH 6.6條件下層析得到的scpDNA純度較高。

圖5 不同洗脫條件下的層析過程Fig. 5 Chromatographic processes under different elution conditions. The cryogel column was equilibrated and washed with 20 mmol/L sodium phosphate buffer of pH 6.6. The liquid velocity was 1.6 mL/min. (solid line) Eluted with 0.4 mol/L NaCl (elution 1) followed by 1 mol/L NaCl (elution 2). (dotted line) Eluted with 0.5 mol/L NaCl (elution 1) followed by 1 mol/L NaCl (elution 2).

在pH 6.6時進(jìn)行層析，用0.4或0.5 mol/L NaCl進(jìn)行第一步洗脫，用1 mol/L NaCl進(jìn)行第二步洗脫，用0.5 mol/L NaOH再生床柱，層析曲線見圖5，電泳結(jié)果見圖6。從圖5中可知，第一步洗脫峰較高，第二步洗脫峰較低，特別是用0.5 mol/L NaCl進(jìn)行第一步洗脫時，1 mol/L NaCl洗脫已幾乎看不到洗脫峰，說明用 0.5 mol/L NaCl一步洗脫足以將目標(biāo)物洗脫下來。從圖 6中可知，洗脫物中雜質(zhì)較少，晶膠柱對scpDNA取得了較理想的分離效果。上樣液中scpDNA濃度較低，電泳圖中未見明顯條帶 (圖6A，泳道2)，在洗脫峰中有明顯的scpDNA條帶，說明晶膠介質(zhì)對scpDNA起到了較好的濃縮作用。在用0.4、1 mol/L NaCl洗脫時，0.4 mol/L NaCl洗脫得到的scpDNA雜質(zhì)較少，純度達(dá)到83.8% (圖6A，泳道9~11)，回收率為29.4%，1 mol/L NaCl洗脫只隱約見scpDNA一條條帶，濃度較低 (圖6A，泳道6~8)；用0.5、1 mol/L NaCl洗脫時，0.5 mol/L NaCl洗脫得到的 scpDNA純度達(dá)到 82.8% (圖6B，泳道3~5)，回收率為33.3%，而1 mol/L NaCl洗脫幾乎看不到條帶 (圖6B，泳道6~8)。0.5 mol/L NaCl洗脫較0.4 mol/L NaCl洗脫得到的scpDNA純度相差不多，但是scpDNA濃度有所提高，所以用0.5 mol/L NaCl一步洗脫更為合適，具體結(jié)果見表1。用0.5 mol/L NaOH可將殘留在晶膠介質(zhì)內(nèi)的scpDNA和其他雜質(zhì)一并洗脫下來使床柱再生 (圖6A，泳道3~5，圖6B，泳道9~10)。用考馬斯亮藍(lán)法對洗脫液進(jìn)行檢測，未檢出蛋白。

圖6 層析收集液的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 6 Agarose gel electrophoresis images of chromatographic eluents. M: DNA marker (10 000, 8 000, 6 000, 5 000, 4 000, 3 500, 3 000, 2 500, 2 000, 1 500, 1 000, 750, 500, 250 bp). (A) 1: pUC19 DNA; 2: loading sample; 3?5: eluted with 0.5 mol/L NaOH; 6?8: eluted with 1 mol/L NaCl; 9?11: eluted with 0.4 mol/L NaCl. (B) 1: pUC19 DNA; 2: breakthrough; 3?5: eluted with 0.5 mol/L NaCl; 6?8: eluted with 1 mol/L NaCl; 9?10: eluted with 0.5 mol/L NaOH.

表1 pH 6.6下層析獲得的scpDNA的純度和濃度，以及晶膠的分離能力Table 1 The purity and concentration of scpDNA obtained by chromatography under pH 6.6, and the corresponding separation capacity of the cryogel

3 結(jié)論

利用自制的超大孔晶膠基質(zhì)，成功接枝DEAE-Dextran得到陰離子交換晶膠介質(zhì)。用該介質(zhì)在pH 6.0、6.6、7.2或7.8條件下進(jìn)行層析，從E. coli裂解液中分離pDNA，分別以0.3、0.35、0.4或0.5 mol/L NaCl進(jìn)行第一步洗脫，1 mol/L NaCl進(jìn)行第二步洗脫，最終找到了獲得較高純度scpDNA的合適層析條件。在pH 6.6條件下進(jìn)行層析，用 0.5 mol/L NaCl一步洗脫得到的scpDNA純度達(dá)到 82.8%，晶膠吸附量達(dá)到5.4 mg/L晶膠介質(zhì)。整個分離過程迅速高效，沒有使用動物源性酶，也沒使用苯酚、氯仿和溴化乙錠等毒性試劑，使操作過程和所獲得的pDNA更加安全。

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