孟子卜，柴文戍

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，遼寧錦州 121001)

銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa，PA)是醫(yī)院內(nèi)感染最常見(jiàn)的致病菌，一旦感染，治療困難。巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫防御細(xì)胞，細(xì)菌侵襲機(jī)體組織，首先要避免被巨噬細(xì)胞等機(jī)體免疫細(xì)胞的吞噬、清除。因此激發(fā)巨噬細(xì)胞凋亡對(duì)細(xì)菌而言很重要。近來(lái)研究顯示，PA以劑量依賴和時(shí)間依賴的方式誘導(dǎo)U937巨噬細(xì)胞凋亡，且與線粒體途徑有關(guān)［1］。本研究采用J774細(xì)胞作為巨噬細(xì)胞的模型［2］，通過(guò)觀察PA上清液誘導(dǎo)J774細(xì)胞凋亡過(guò)程中Fas蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步探討PA上清液誘導(dǎo)J774細(xì)胞凋亡的致病機(jī)制，為開(kāi)發(fā)新型抗感染藥物提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 PA采用標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27853，由遼寧醫(yī)學(xué)院提供。J774細(xì)胞由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。Hoechst 33258凋亡試劑盒購(gòu)自大連寶生物技術(shù)有限公司，Annexin-V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物公司，兔抗鼠Fas抗體購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法 PA用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，通過(guò)增菌，離心，過(guò)濾獲得上清液。J774細(xì)胞置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使J774細(xì)胞與PA上清液0.15的濃度混合3、6、9 h獲得感染的J774細(xì)胞。采用熒光染色觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)，Annexin-V-FITC/PI雙染分析測(cè)定細(xì)胞凋亡率，Western blot法測(cè)定Fas蛋白含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩組比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 熒光染色 感染3 h時(shí)，就可見(jiàn)到少量的凋亡細(xì)胞;6 h時(shí)，細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化;9h時(shí)，產(chǎn)生凋亡小體。

2.2 Annexin-V-FITC/PI雙染分析 對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)3、6、9 h組的細(xì)胞凋亡率見(jiàn)Tab 1。組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.01)。

Tab 1 Rate of apoptosis of J774(±s)

Tab 1 Rate of apoptosis of J774(±s)

＊＊P＜0.01 vs control

Time/h Annexin-V-FITC/PI/% 0 4.51±0.76 3 27.91±1.63＊＊6 42.85±2.34＊＊9 68.60±2.30＊＊

2.3 Western blot法測(cè)定Fas蛋白含量 對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)3、6、9 h組Fas蛋白表達(dá)相對(duì)值見(jiàn)Tab 2。與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.01)。

Tab 2 Relative expression value of Fas protein

3 討論

目前對(duì)于PA感染巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，國(guó)內(nèi)外研究還很少。已有研究顯示，各種因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡均出現(xiàn)線粒體功能紊亂［3］，但是否有Fas/Fas L死亡受體途徑參與目前尚不清楚。

對(duì)于Fas/Fas L死亡受體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制已經(jīng)進(jìn)行了較深入的研究［4］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Western blot法檢測(cè)Fas蛋白，證明與Fas/Fas L死亡受體途徑與PA上清液誘導(dǎo)J774細(xì)胞凋亡過(guò)程有關(guān)。

綜上所述，PA上清液誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡可能與Fas/Fas L死亡受體途徑有關(guān)。因此尋找抑制Fas/Fas L死亡受體途徑的藥物治療各種PA相關(guān)性疾病有著良好的應(yīng)用前景。

［1］ 朱小敏，柴文戍.銅綠假單胞菌感染誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡的研究［J］.中國(guó)病原生物學(xué)雜志，2008，3(4):263－5.

［1］ Zhu X M，Chai W S.The research of Pseudomonas aerugionsa-induced apoptosis of U937 cells［J］.China Pathog Biol J，2008，3 (4):263－5.

［2］ Zhang J L，Takayama H，Matsuba T，et al.Induction of apoptosis in macrophage cell line，J774，by the cell-free supernatant from Pseudomonas aeruginosa［J］.Microbiol Immunol，2003，47(3): 199－206.

［3］ 吳 靜，楊國(guó)棟，路 紅，等.D-氨基葡萄糖衍生物誘導(dǎo)Eca-109凋亡的機(jī)制［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2008，24(1):33－6.

［3］ Wu J，Yang G D，Lu H，et al.Effect of derivatives of D-aminoglucose on the reactive oxygen species and mitochondrial membrane ptoential change of Eca-109 cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(1):33－6.

［4］ Gehring S，Rottmann S，Menkel A R，et al.Inhibition of proliferation and apoptosis by the transcriptional repressor Mad1.repression of Fas induced caspase 8 activation［J］.J Biol Chem，2000，275 (14):10413－43.