吳行偉，劉澤源，李 前，蒲韻竹，任汝通，許秀麗，劉霏霏，張 琴，吳 媛，曲恒燕

(1.解放軍總醫(yī)院，北京 100850;2.軍事醫(yī)學科學院附屬醫(yī)院臨床藥理室，北京 100071; 3.軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所，北京 100850)

pBV220質粒是由我國科學家自主構建的高效表達載體［1］，現已實現了多種活性蛋白的高效表達。CNTF即睫狀神經營養(yǎng)因子，它能促使多種神經細胞的存活，是第1個被發(fā)現的能維持在體和離體脊髓運動神經元的存活及突起生長的營養(yǎng)因子［2－5］;PTD即蛋白轉導域，是一種能攜帶生物大分子穿透生物膜的多肽結構［6］。將改構的CNTF(tCNTF)與PTD連接導入質粒pBV220(pBV220-PTD-tCNTF)后經表達可得到能穿越生物膜的截短式神經營養(yǎng)因子［4］，但表達以包涵體形式存在難以純化。為解決不溶性表達問題我們嘗試將易于可溶性表達的改造菌株制作為感受態(tài)細胞，轉入質粒pBV220-PTD-tCNTF，并探索其高效轉化方法。

感受態(tài)細胞的制備有很多方法，通常包括物理法和化學法。物理法即電轉化法［7－8］，此種方法快速高效，但設備昂貴，技術要求高?；瘜W法中最早也最為經典的是氯化鈣法，這種方法由Mendel［9］建立于1970年，成為實驗室制備感受細胞的一種常規(guī)技術，其后在此基礎上有很多改進方法。一般認為緩沖液中的Ca2+、Mg2+等二價陽離子可提高轉化效率，PEG在濃度為10 g·L－1分子量在8 000和3 350時效果最好，DMSO可提高轉化效率，而對于甘油是否能提高轉化效率，不同的研究有不同的看法。本實驗室以提高質粒轉化效率為目的，分別嘗試幾種制備方法，通過設計實驗分析并驗證上述常見因素對pBV220-PTD-tCNTF轉化感受態(tài)細胞轉化率的影響，得出最優(yōu)的水平組合，從而得到具有高轉化效率的感受態(tài)制備方法，并經測序確定質粒轉入的正確性。

1 材料與方法

1.1 材料 經改造后的大腸桿菌BL21菌種由21世紀生物技術研究所曹利民博士惠贈，含有PTD-tCNTF蛋白序列的pBV220質粒(Amp抗性)，為軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所構建并保存。

1.2 制備大腸桿菌感受態(tài)細胞的方法 氯化鈣法采用常規(guī)制備方法，INOUE法［10］TSSG法［11］和CaCl2-甘油法［12］分別參照文獻方法進行，平行5次。

1.3 質粒的轉化 取感受態(tài)細胞100 μl(新鮮制備和－80℃保存30 d)，冰上放置20 min，低溫無菌操作加質粒1 μl，冰浴30 min，42℃熱擊90 s，立即冰浴2 min，每管加無抗生素LB液體培養(yǎng)基200 μl，37℃ 200 r·min－1振搖1 h，取100 μl涂LB固體培養(yǎng)板(含100 mg·L－1Amp)，次日觀察菌落數，并計算轉化效率。

陰性對照:取經氯化鈣法制備的未轉化質粒的感受態(tài)細胞100 μl涂LB固體培養(yǎng)板(含100 mg·L－1Amp)，次日觀察菌落數;陽性對照:取經氯化鈣法制備的感受態(tài)細胞轉化質粒后100 μl涂LB固體培養(yǎng)板(無Amp)次日觀察菌落數。

1.4 正交設計研究Mg2+、INOUE重懸液、PEG、甘油和DMSO對pBV220-PTD-tCNTF轉化感受態(tài)細胞即時轉化率的影響

1.4.1 正交設計因素水平 試驗共設5個影響因素，分別為“培養(yǎng)基與重懸液中Mg2+加與不加”(A)，“INOUE重懸與否”(B)，“培養(yǎng)中PEG加與不加”(C)，“重懸液中甘油加與不加”(D)，“重懸液中DMSO加與不加”(E)。參照文獻［11］，Mg2+采用MgCl2，濃度為50 mmol·L－1，PEG為100 g ·L－1，甘油終濃度為120 g·L－1，DMSO終濃度為70 g· L－1。

1.4.2 實驗操作 依據Tab 1正交設計，挑取單克隆菌落至100 ml LB各試驗號液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD=0.5，冰浴20 min，低溫無菌操作向1、3、6、8號培養(yǎng)基中加6 ml DMSO，混勻，分裝入50 ml離心管中，4℃ 5 000 r·min－1離心10 min，以各重懸液重懸，4℃ 5 000 r·min－1離心10 min，加2 ml重懸液重懸后100 μl分裝。按“1.4質粒的轉化”操作轉化各試驗組所得感受態(tài)細胞，并于次日觀察菌落數，計算轉化效率，并找出最高轉化效率的水平組合。

Tab 1 Orthogonal design L8(27)

1.4.3 依據正交設計得出的最佳水平組合重復試驗 挑取單菌落活化后于TSSG培養(yǎng)液中37℃，200 r·min－1培養(yǎng)至OD=0.4－0.6，冰浴20 min，加入終濃度60 g·L－1DMSO迅速混勻，4℃，5 000 r·min－1，離心10 min，用含60 g·L－1DMSO的Inoue液30 ml重懸后4℃，5 000 r·min－1，離心10 min，吸出28 ml上清，余液重懸菌體后以100 μl每管分裝入預冷EP管，－80℃保存。按“1.3”方法轉化，計算轉化效率并挑取菌落活化后交由華大基因公司測序。

1.5 轉化效率的計算 轉化效率即1 μg質粒轉化感受態(tài)細胞所得的轉化子數目，計算公式如下:轉化效率(E)=菌落數×稀釋倍數/質粒DNA加入量。

1.6 統(tǒng)計學分析 結果分析采用SAS9.1標準版計算平均值及標準差，Excel作圖，正交設計結果采用正交設計定量資料的方差分析(GLM過程)進行統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1 陰性對照與陽性對照的比較 未轉化質粒的感受態(tài)細胞涂不含Amp抗生素的LB平板(即陽性對照)，菌株長滿皿底;未轉化質粒的感受態(tài)細胞涂含Amp抗生素的LB平板(即陰性對照)，皿中無菌落出現(Fig 1)。說明Amp抗生素具有明顯抑制無抗性菌株生長的作用，且所用菌株無抗Amp突變菌的出現。

Fig 1 Results of positive control and negative control

2.2 不同大腸桿菌感受態(tài)細胞轉化率的比較 pBV220-PTD-tCNTF質粒轉化4種方法制備的感受態(tài)細胞的效率最高的是INOUE法為(8.52±1.22)×107，CaCl2法，CaCl2-甘油法，TSSG法的轉化率分別為:(5.43±0.72)×106、(7.45 ±0.65)×106、(9.71±1.81)×106;感受態(tài)細胞－80℃保存30 d后的轉化效率分別為:CaCl2法(6.20±0.31)×104; CaCl2-甘油法(6.57±0.97)×106;TSSG法(9.76±1.31)× 106;INOUE法(1.63±0.019)×106(Fig 2)。

2.3 正交設計研究Mg2+、INOUE重懸液、PEG、甘油和DMSO對pBV220-PTD-tCNTF即時轉化感受態(tài)細胞轉化率的影響

2.3.1 總模型 F值=22.04，P=0.044，R2=0.9822總模型具有統(tǒng)計學意義。

2.3.2 因素各統(tǒng)計量與各水平平均值 見Tab 3，5個影響因素中A和B的P值小于0.05，說明“Mg2+加否”和“Inoue重懸與否”對轉化率影響的差異具有統(tǒng)計學意義，而“PEG加否”，“甘油加否”，和“DMSO加否”對結果影響的差異不具有統(tǒng)計學意義，幾個因素中“Inoue重懸與否”P值最小，說明其對pBV220-PTD-tCNTF質粒轉化感受態(tài)細胞的影響最大。

Tab 2 Statistics of the factors and mean values of each level to its factors(×106)

Fig 2 Logarithms to transformation efficiencies of 4 approaches to get competent cells immediately and after a storage for 30 days

ABCE的1水平平均值均大于2水平，其中B因素“Inoue重懸與否”的平均值差異最大，其次是A因素“Mg2+加否”;D因素“甘油加否”1水平平均值小于2水平，說明甘油對pBV220-PTD-tCNTF轉化感受態(tài)細胞有抑制作用，其他因素可提高其轉化效率。

由上述結果得到最優(yōu)的水平組合為A1B1C1D2E1，與預測相符。重復最佳水平組合試驗得到的轉化率為(29.63± 4.95)×107。

2.4 最優(yōu)組合制備菌樣測序 將最優(yōu)組合制備并轉化好的BL21菌株交由華大基因測序公司進行測序，結果顯示，轉化生長的菌體含有pBV220轉入的PTD-tCNTF基因序列，并無突變序列的存在。

3 討論

本試驗所用4種方法除了TSSG緩沖液之外其余緩沖液中皆有CaCl2的使用。從4種方法的轉化率比較看來，CaCl2法對質粒pBV220-PTD-tCNTF轉化大腸桿菌BL21的效率偏低，且－80℃保存30 d后的轉化率降低程度很大。加15%甘油后的轉化率有些許提高，且－80℃保存30 d后的轉化效率提高很多，說明甘油作為凍存保護劑對于保持感受態(tài)細胞轉化效率具有積極的效果。本實驗也嘗試了代紅星等［11］在TSS法的基礎上改進的TSSG法，按其報道方法操作得到的轉化效率，約為CaCl2法的兩倍，TSSG法被稱為“一步制備法”，這種方法簡便易行，不需低溫離心，對于缺乏低溫離心設備的實驗室是理想的選擇。最早的INOUE法是Castumase等［13］在1995年報道的，后在其基礎上有少許改進，這種方法轉化率非常高，被稱為“超高效法”，但其－80℃的保存轉化效率有一定程度的降低。

影響質粒轉化感受態(tài)細胞轉化效率的因素有很多，如質粒大小不同，所得的轉化效率就不一致，一般4～7.3 kb時差別不大，質粒越大轉化效率相應的會越低，pBV220-PTD-tCNTF約為3.7 kb，屬于較小的質粒，故轉化率比大的質粒稍高。各考察因素對pBV220-PTD-tCNTF轉化感受態(tài)細胞轉化率的影響中INOUE重懸液的重懸與否對結果的影響最大，其與重懸液中Mg2+添加與否在95%的置信區(qū)間內均具有統(tǒng)計學意義，INOUE重懸液中含有Mn2+、Ca2+、K+和PIPES，可見各種金屬陽離子的存在可明顯提高pBV220-PTD-tCNTF轉化感受態(tài)細胞的轉化效率。正交設計結果顯示因素PEG3350的P值為0.0677，說明其對本實驗的轉化效率有一定影響，從其轉化效率的平均值來看，培養(yǎng)基中加PEG3350有助于提高pBV220-PTD-tCNTF轉化感受態(tài)細胞。因素D重懸液中甘油添加與否和因素E DMSO添加與否的P值均大于0.05，說明從統(tǒng)計學角度來看甘油和DMSO的添加對于本實驗的轉化效率沒有明顯影響，而從平均值來看添加甘油是不利于提高轉化效率的。在CaCl2-甘油法與單純CaCl2法的比較中可發(fā)現添加甘油有助于提高保存轉化效率。而TSSG法中未添加甘油也得到了很高的保存轉化效率，說明DMSO也可能具有較好的提高保存轉化效率的作用。實驗得到的最優(yōu)組合基本符合各因素的影響方式，且確定了甘油對轉化效率的抑制作用。

在實驗設計方面采用L8(27)正交設計這種方法的優(yōu)點是可以通過犧牲因素間的交互作用來達到減少試驗次數的目的。本實驗因素全組合(含重復試驗)的最少試驗次數為26，即64次，而采用正交設計只需8次試驗即可達到觀察每個因素對結果的影響，且正交表中空白兩列可用來估計實驗誤差，達到了節(jié)約試驗成本的目的。

PTD蛋白與CNTF結合后可攜帶后者透過生物屏障，使其更好的發(fā)揮治療神經系統(tǒng)疾病的效應。采用pBV220載體后雖然對融合蛋白有很高的表達效率，但由于包涵體的存在，蛋白的純化與復性成為其具繼續(xù)成藥的瓶頸。本實驗我們采用PBV220-PTD-tCNTF質粒轉化經基因工程改造過的大腸桿菌BL21，得到了占總表達量約40%的可溶性表達蛋白，為后續(xù)目的蛋白的大量獲得開辟了道路。

［1］ 張智清，姚立紅，侯云德.含PRPL啟動子的原棱高效表達載體的組建及其應用［J］.病毒學報，1990，6:111－6.

［1］ Zhang Z Q，Yao L H，Hou Y D.Construction and application of a high level expression vector containing PRPLpromoter［J］.Chin J Virol，1990，6:111－6.

［2］ Sendner M，Arakawa Y，Stockli K，et al.Effect of ciliary neurotrophi factor on motonneuron survival［J］.Cell Sei Suppl，1991，15:103－9.

［3］ 石向群，陳興洲，陸兵勛.睫狀神經營養(yǎng)因子及受體的研究進展［J］.國外醫(yī)學·腦血管疾病分冊，1999，7(2):76－9.

［3］ Shi X Q，Chen X Z，Lu B X.The research progression of CNTF and it，s receptor［J］.Cerebrovascul Dis Fore Med Sci，1999，7(2): 76－9.

［4］ 曲恒燕，劉澤源，李媛媛，孫曼霽.TAT-tCNTF融合蛋白對Aβ25-35誘導SH-SY5Y細胞損傷的保護作用［J］.中國藥理學通報，2010，26(4):442－6.

［4］ Qu H Y，Liu Z Y，Li Y Y，Sun M J.Protective effects of TAT-tCNTF fusion protein on SH-SY5Y cells induced by β-amyloid peptide(25-35)［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(4):442－6.

［5］ 張予陽，于慶海.神經營養(yǎng)因子對缺血性腦損傷的影響及其藥物調節(jié)［J］.中國藥理學通報，2003，19(3):261－4.

［5］ Zhang Y Y，Yu Q H.Effects of neurotrophic factors on ischemic damage and the regulation by medicines［J］.Chin Pharmacol Bull，2003，19(3):261－4.

［6］ Gump J M，Dowdy S F.TAT transduction:the molecular mechanism and therapeutic prospects［J］.Trends Mol Med，2007，13 (10):443－8.

［7］ Dower W J，Miller J F，Ragsdale C W.High efficiency transformation of E.coli by high voltage electroporation［J］.Nucleic Acids Res，1988，16:6127－45.

［8］ Potter H.Application of electroporation in recombinant DNA technology［J］.Methods Enzymol，1993，217:461－83.

［9］ Mandel M.Calcium dependent bacteriophage DNA infection［J］.Mol Biol，1970，53(1):159－62.

［10］楊 坤，鞏振輝，李大偉.大腸桿菌高效感受態(tài)細胞的制備及快捷轉化體系的建立［J］.北方園藝，2010(14):127－30.

［10］Yang K，Gong Z H，Li D W.The preparation of super E.coli competent cell and the establishment of fast plasmid transformation into E.coli［J］.North Horticult，2010(14):127－30.

［11］代紅星，張慶橋，樊寶良.一種簡捷有效的大腸桿菌感受態(tài)細胞制備方法［J］.安徽農業(yè)科學，2008，36(29):12627－8.

［11］Dai H X，Zhang Q Q，Fan B L，A simple and effective method for preparation of E scherichia coli competent cells［J］.J Anhui Agr Sci，2008，36(29):12627－8.

［12］劉衛(wèi)今，蔣 勇，完迪迪.簡單高效的感受態(tài)細胞制備和質粒轉化體系的建立［J］.安徽農業(yè)科學，2008，36(7):2745－6.

［12］Liu W J，Jiang Y，Wan D D.Study on a simple and efficient preparation of competent cell and the establishment of plasmid transformation system［J］.J Anhui Agr Sci，2008，36(7):2745－6.

［13］Castuma C E，Huang R P，kornberg A，Reusch R N.Inorganic polyphosphosphates in the acquisition of competence in Escherichia coli［J］.JBC，1995，270(22):19280－3.