何彰華，王洋，葉丙雨，師明磊，王東，范秋聲，黃芬，趙志虎

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所，北京100071

天然小分子藥物一直是人類抵御疾病的重要手段，抗生素的發(fā)現(xiàn)及其使用，拯救了成千上萬人的生命，但是大量抗性致病菌如耐萬古霉素、甲氧西林抗性等“超級細(xì)菌”的出現(xiàn)，極大地威脅著人類生命健康[1]。一些危險的致病菌正對現(xiàn)有抗生素產(chǎn)生耐藥性，它們進(jìn)化的速度甚至超過了科學(xué)家開發(fā)新型藥物的速度。因此如何建立組合性生物合成平臺，更加有效利用現(xiàn)有天然小分子資源，開發(fā)新型抗生素，意義重大。

聚酮是來源于放線菌等的一大類結(jié)構(gòu)復(fù)雜、活性多樣、臨床應(yīng)用廣泛的化合物。負(fù)責(zé)聚酮合成的模塊性聚酮合成酶 (Polyketide synthase，PKS) 的多個基因成簇排列、活性位點的排列順序與聚酮分子的合成步驟、產(chǎn)物結(jié)構(gòu)間具有一一對應(yīng)關(guān)系，特別適合利用基因工程等手段，進(jìn)行組合性改造[2-3]。紅霉素是一種典型的模塊類聚酮抗生素，對紅霉素結(jié)構(gòu)的改造和修飾最有可能產(chǎn)生新型抗生素[4-6]。6-脫氧-紅霉內(nèi)酯B (6dEB)是紅霉素生物合成過程中可分離出來的第一個中間體，其合成的分子機制已經(jīng)研究得比較透徹，合成過程由紅霉素聚酮合成酶模塊介導(dǎo)完成[7]，但在大腸桿菌中異源合成6dEB卻存在幾個難點[8]。2001年P(guān)feifer等[9]選擇基因組中整合有枯草桿菌磷酸泛酰巰基轉(zhuǎn)移酶基因sfp的大腸桿菌BAP1作為表達(dá)宿主，以實現(xiàn)聚酮合成酶中?；\載蛋白 ACP的翻譯后修飾；再應(yīng)用天藍(lán)色鏈霉菌的丙酰-CoA羧化酶基因 accA1、pccB以保障6dEB合成前體的供給；將合成6dEB必需的基因克隆于雙質(zhì)粒系統(tǒng) pBP130和 pBP144 (表 3)，首次在大腸桿菌 BAP1中以丙酸鈉為底物異源合成了6dEB。

本研究旨在建立一個紅霉素組合性生物合成的平臺，即在大腸桿菌中重建紅霉素大環(huán)內(nèi)酯(6-脫氧-紅霉內(nèi)酯 B，6dEB) 合成通路。實驗中先將參與6dEB合成所必需的基因分別克隆于多基因串聯(lián)共表達(dá)載體[10]，獲得單基因重組質(zhì)粒；再利用載體中 XbaⅠ/SpeⅠ互為同尾酶的特性實現(xiàn)相關(guān)基因的串聯(lián)組合，獲得多基因重組質(zhì)粒pBJ130和 pBJ144。將多基因重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化BAP1，獲得含6dEB合成通路的工程菌株BAP1 (pBJ130/pBJ144)，并對其進(jìn)行了鑒定。研究中克服了高GC、長片段基因的PCR擴增，成功獲取聚酮合成酶基因eryAI、eryAII、eryAIII；構(gòu)建的多基因重組質(zhì)粒中各基因分別位于獨立的表達(dá)盒中，每個基因含單獨的啟動子和終止子，SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示通路中各基因均有明顯的表達(dá)；初步進(jìn)行低溫發(fā)酵，乙酸乙酯萃取后制樣質(zhì)譜檢測到 6dEB，用紅霉素標(biāo)準(zhǔn)品作內(nèi)參得出其產(chǎn)量約 10 mg/L。研究成功實現(xiàn)了 6dEB合成通路在大腸桿菌中的重建，為紅霉素大環(huán)內(nèi)酯的改造和修飾提供了平臺，也為紅霉素合成通路在大腸桿菌中的完整重建以及聚酮類抗生素的組合性生物合成奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

紅霉素鏈霉菌Streptomyces erythraea購于中國農(nóng)業(yè)菌種保藏管理中心；天藍(lán)色鏈霉菌Streptomyces coelicolor購于 ATCC；表達(dá)宿主BAP1由塔夫茨大學(xué)化學(xué)與生物工程系 Blaine Pfeifer教授惠贈；大腸桿菌DH5a感受態(tài)和BL21感受態(tài)均購于天根公司；多基因串聯(lián)表達(dá)載體pET-m22b (+) 和 pET-m28a (+) 由本實驗室構(gòu)建保存，(+) 代表含有f1復(fù)制區(qū)。

1.2 工具酶與化學(xué)試劑

T4 DNA連接酶購于NEB；DNA marker購于北京全式金生物公司；蛋白 marker為Fermentas產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶和 Primer STAR聚合酶為TaKaRa產(chǎn)品；普通質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒均購于天根公司。

氨芐青霉素、卡那霉素購自AMRESCO公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.3 研究中使用的基因

基因的信息均源自NCBI數(shù)據(jù)庫。分子伴侶基因 groES-EL為本實驗室克隆保存，其他基因為本實驗克隆 (表1)。

1.4 引物設(shè)計與片段的擴增

引物的設(shè)計依照NCBI數(shù)據(jù)庫中報道的基因序列，上、下游引物中分別設(shè)計合適的酶切位點用于克隆，具體信息見表2。

研究中的基因序列均富含 GC，且聚酮合成酶3個基因片段較長，約10 kb，PCR反應(yīng)條件要求較嚴(yán)格。高GC、長片段PCR反應(yīng)程序為 (兩步法)：94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，70 ℃ 11 min，25個循環(huán)；72 ℃ 10 min，體系中加入5%的DMSO；高GC、短片段PCR反應(yīng)程序為：94 ℃2 min；98 ℃ 10 s，64 ℃ 5 s，72 ℃ 90 s，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。

表1 文中所使用的基因Table 1 Gene used in the study

表2 文中所用引物及其序列Table 2 Primer and sequence used in the study

1.5 菌種的復(fù)蘇培養(yǎng)與DNA的提取

菌種的復(fù)蘇培養(yǎng)參照中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心提供的真空冷凍干燥菌種的恢復(fù)培養(yǎng)方法。復(fù)蘇好的菌種挑單菌落轉(zhuǎn)接入新鮮液體培養(yǎng)基，30 ℃振蕩培養(yǎng)3~5 d，離心收集菌體，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取全基因組 DNA。菌種的復(fù)蘇培養(yǎng)采用高氏一號培養(yǎng)基。

1.6 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

先將PCR獲取的目的基因分別克隆入多基因串聯(lián)表達(dá)載體pET-m28a (+) 或pET-m22b (+)，進(jìn)行酶切及測序鑒定；再利用多基因串聯(lián)表達(dá)載體中XbaⅠ和SpeⅠ互為同尾酶的特性，通過酶切、連接實現(xiàn)相關(guān)基因的串聯(lián)組合。多基因的組合策略如圖1所示，組合模式見表3。

1.7 基因的表達(dá)鑒定

將構(gòu)建成功的單基因重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化BL21進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)鑒定；將構(gòu)建正確的多基因重組質(zhì)粒pBJ130和pBJ144分別轉(zhuǎn)化BAP1，用相應(yīng)的抗生素篩選單克隆，獲得表達(dá)菌株BAP1 (pBJ130) 和BAP1 (pBJ144)；將重組質(zhì)粒pBJ130和pBJ144共轉(zhuǎn)化BAP1，用氨芐青霉素和卡那霉素篩選單克隆，獲得含6dEB合成通路的工程菌株BAP1 (pBJ130/pBJ144)。誘導(dǎo)前先接菌至相應(yīng)抗生素培養(yǎng)基中培養(yǎng)至飽和，誘導(dǎo)時按1%的比例轉(zhuǎn)接至2 mL新鮮的培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)約1 h，待OD600值達(dá)到0.4~0.6，加入IPTG (終濃度為0.5 mmol/L)，于37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。各取1 mL菌液高速離心 1 min，沉淀懸于 100 μL 1×SDS凝膠上樣緩沖液，沸水浴6 min，離心收集上清，取少量樣品進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。

1.8 6dEB的合成與檢測

接菌BAP1 (pBJ130/pBJ144) 至2 mL新鮮的氨芐青霉素和卡那霉素 LB培養(yǎng)基中37 ℃過夜培養(yǎng)。將活化的菌按 1%的接菌量轉(zhuǎn)接至2 mL新鮮的LB (加雙抗) 培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)，待OD600值達(dá)到0.6時將菌液于 22 ℃放置 5 min，加入 0.5 mmol/L IPTG、2.5 g/L丙酸鈉，置于22 ℃、200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

將上述低溫誘導(dǎo)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至離心管中12 000 r/min離心1 min，上清移至另一無菌的離心管中，加入等體積的乙酸乙酯萃取。將萃取的有機相在室溫下風(fēng)干，再溶于100 μL甲醇，樣品送至軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院儀器中心進(jìn)行質(zhì)譜檢測。在用乙酸乙酯萃取前，往發(fā)酵液中加入10 mg/L的紅霉素標(biāo)準(zhǔn)品作內(nèi)參[11]。

圖1 多基因表達(dá)盒的串聯(lián)策略Fig. 1 Schematic diagram of combination strategies.

表3 文中所用菌株和質(zhì)粒Table 3 Strain and plasmid in the study

2 結(jié)果

2.1 目的基因的獲取

以提取的紅霉素鏈霉菌基因組 DNA為模板，用設(shè)計的引物選擇 Primer STAR分別進(jìn)行PCR擴增，成功獲取 eryAI、eryAII、eryAIII三個基因，特異性均較好，結(jié)果見圖2A~C。以提取的天藍(lán)色鏈霉菌基因組DNA為模板，用設(shè)計的引物選用 Primer STAR聚合酶，成功擴取accA1和pccB，結(jié)果見圖2D。

2.2 質(zhì)粒的構(gòu)建

2.2.1 構(gòu)建單基因重組質(zhì)粒

應(yīng)用設(shè)計的酶切位點，將 PCR擴取的目的基因eryAI、accA1、pccB分別克隆入pET-m28a (+)；eryAII、eryAIII分別克隆入pET-m22b (+)。用 Nde Ⅰ和 Hind Ⅲ分別對構(gòu)建的單基因重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，電泳結(jié)果見圖3，均切下相應(yīng)目的片段。利用通用引物并結(jié)合設(shè)計的測序引物將上述構(gòu)建的單基因質(zhì)粒分別進(jìn)行測序鑒定，序列比對結(jié)果顯示各基因均無堿基突變。

圖2 目的片段的PCR擴增Fig. 2 PCR amplification of target fragment. (A) eryA. (B) eryAII. (C) eryAIII. (D) 1,2: accA1 PCR product; 3,4: pccB PCR product.

2.2.2 構(gòu)建多基因質(zhì)粒

利用XbaⅠ和SpeⅠ互為同尾酶的特性，選擇合適的酶切位點 (如BglⅡ、Sph Ⅰ等)，按圖1所示多基因串聯(lián)組合策略同時參照表3的組合模式完成相關(guān)基因的組合，獲得多基因重組質(zhì)粒pBJ130和pBJ144。用NdeⅠ分別酶切多基因重組質(zhì)粒，電泳結(jié)果如圖4所示，切下的基因片段均與預(yù)期一致。NdeⅠ單酶切后，基因片段上均帶有約265 bp的連接序列。

2.3 基因的表達(dá)結(jié)果

2.3.1 單基因表達(dá)結(jié)果

單基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后分別誘導(dǎo)，制備蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測，目的蛋白條帶清晰，大小正確，單個基因均能在大腸桿菌中表達(dá) (圖5)。

2.3.2 多基因共表達(dá)結(jié)果

誘導(dǎo)后，制備蛋白樣品進(jìn)行 SDS-PAGE檢測，在大腸桿菌BAP1中相應(yīng)的基因均有較明顯的表達(dá)，其中 eryAI、eryAII、eryAIII分子量較大，表達(dá)量相對較低。編號2中eryAII、eryAIII條帶均較明顯，eryAII表達(dá)量相對較少；編號3中5個基因共表達(dá)，groEL、pccB分子量接近條帶重疊，accA1條帶均較明顯，eryAI表達(dá)量相對較低，groES分子量較小已跑出膠底；編號 4中7個基因共表達(dá)，其中eryAI、eryAII分子量接近兩蛋白條帶重疊，groEL、pccB分子量接近兩蛋白條帶重疊，accA1、eryAIII條帶均較明顯，groES分子量較小已跑出膠底 (圖6)。

圖3 單基因重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig. 3 Restriction digestion analysis of recombinant plasmid. M: DNA marker. (A) 1: pET-m28a-eryAI; 2: pET-m28a-eryAI/Nde I+Hind III. (B) 1: pET-m22b-eryAII; 2: pET-m22b-eryAII/Nde I+Hind III. (C) 1: pET-m22b-eryAIII; 2: pET-m22b-eryAIII/Nde I+Hind III. (D) 1: pET-m28a-accA1; 2: pET-m28a-accA1/Nde I+Hind III; 3: pET-m28a-pccB; 4: pET-m28a-pccB/Nde I+Hind III.

圖4 多基因重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig. 4 Enzyme digestion analysis of multi-genes recombinant plasmid. M: DNA marker. (A) 1: pBJ144; 2: pBJ144/Nde I. (B) 1: pBJ130; 2: pBJ130/Nde I. V shows vector.

圖5 SDS-PAGE檢測單基因表達(dá)結(jié)果Fig. 5 SDS-PAGE analysis of the induced single genes expression individually. M: protein marker. (A) 1: BL21 (DE3)/pET-m28a-accA1 uninduced; 2: BL21 (DE3)/pET-m28a-accA1 induced; 3: BL21 (DE3)/pET-m28a-pccB induced. (B) 1: BL21 (DE3)/pET-m22b-eryAIII uninduced; 2: BL21 (DE3)/pET-m22b -eryAIII induced; 3: BL21 (DE3)/ pET-m22b-eryAII induced; 4: BL21 (DE3)/pET-m28a-eryAI induced. Arrow shows target protein.

圖6 SDS-PAGE檢測多基因共表達(dá)結(jié)果Fig. 6 SDS-PAGE analysis of the induced multi-genes expression simultaneously. M: protein marker; 1: BAP1 (pBJ130) uninduced; 2: (pBJ130) induced; 3: BAP1 (pBJ144) induced; 4: BAP1 (pBJ144/pBJ130) induced. Arrow shows interest protein.

2.4 6dEB的合成與檢測

收集BAP1 (pBJ144/pBJ130) 低溫誘導(dǎo)產(chǎn)物，萃取后風(fēng)干再溶于甲醇，將樣品送去做質(zhì)譜檢測。質(zhì)譜結(jié)果如圖 7所示：在 409.2565處出現(xiàn)6dEB的加鈉峰，734.4753為10 mg/L紅霉素標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜峰；6dEB的峰值略高于內(nèi)參紅霉素標(biāo)準(zhǔn)品，初步判斷6dEB的產(chǎn)量約10 mg/L。

圖7 質(zhì)譜檢測結(jié)果Fig. 7 Mass spectrum results of 6dEB. shows target profiles.

3 討論

本研究應(yīng)用多基因串聯(lián)表達(dá)載體實現(xiàn)了參與 6dEB合成的多個基因在大腸桿菌中的共表達(dá)，完成了6dEB合成通路在大腸桿菌中的重建，首次在國內(nèi)實現(xiàn)以丙酸鈉為底物在大腸桿菌中異源合成了 6dEB。初次誘導(dǎo)發(fā)酵，以紅霉素標(biāo)準(zhǔn)品作內(nèi)參得其產(chǎn)量約 10 mg/L，這與 2001年P(guān)feifer等[9]獲得的產(chǎn)量基本一致。研究借鑒了Pfeifer等[9]的表達(dá)策略，但在重組質(zhì)粒的構(gòu)建過程中我們做了適當(dāng)?shù)母纳?，?yīng)用了本實驗室構(gòu)建的多基因串聯(lián)共表達(dá)載體，在本研究構(gòu)建的6dEB合成通路中，各基因分別位于獨立的表達(dá)盒中，每個基因含單獨的啟動子和終止子 (表3)，避免了多基因共用啟動子時的翻譯極性效應(yīng)，有望在后期的研究中通過調(diào)節(jié)啟動子強弱對基因的表達(dá)進(jìn)行更為精細(xì)的調(diào)控，以提高6dEB在大腸桿菌中的合成效率。

研究中的紅霉素鏈霉菌及天藍(lán)色鏈霉菌基因組GC含量比較高，而富含GC序列的DNA 片段特別是長片段的PCR擴增通常存在一定困難。在早期的研究中，我們選擇Roche公司的Expand Long Template PCR System，通過不同條件的優(yōu)化，擴增了5 kb富含GC的基因[12]；使用Finzyme公司的DynaZyme EXT，在PCR體系中加入10%的DMSO，成功擴取了聚酮合成酶基因eryAIII，但特異性不理想[13]。本實驗中，我們再次對高GC、長片段基因的PCR擴增進(jìn)行了探索，使用TaKaRa公司的 Primer STAR聚合酶成功實現(xiàn)eryAI、eryAII、eryAIII的特異性擴增。將PCR獲取的目的基因分別克隆入多基因串聯(lián)共表達(dá)載體后，酶切鑒定無誤，測序結(jié)果顯示各基因均無堿基突變。

在大腸桿菌中構(gòu)建6dEB合成通路，需要涉及多個基因的共表達(dá)，且巨大蛋白在大腸桿菌中的高效表達(dá)，是一個比較棘手的問題。研究中合理的應(yīng)用多基因串聯(lián)表達(dá)載體，便捷地實現(xiàn)了相關(guān)基因的串聯(lián)組合；通過分子伴侶的共表達(dá)，可以促進(jìn)外源蛋白的折疊，增加巨大蛋白的可溶性[14]。單基因的誘導(dǎo)表達(dá)鑒定結(jié)果顯示：參與6dEB合成的相關(guān)基因均能在大腸桿菌中異源表達(dá)，且表達(dá)量較高 (圖5)。在多基因的誘導(dǎo)共表達(dá)鑒定結(jié)果中，由于部分蛋白分子量接近而發(fā)生條帶重疊現(xiàn)象，且分子量較大的基因 eryAI、eryAII、eryAIII表達(dá)量相對較低，但仔細(xì)對比各泳道中目的蛋白的表達(dá)情況可以初步判斷各基因均能協(xié)同表達(dá)。發(fā)酵產(chǎn)物的質(zhì)譜分析直接證實相關(guān)基因的確都正確表達(dá)了，同時這也進(jìn)一步證實了本實驗室構(gòu)建的多基因串聯(lián)共表達(dá)載體有著重要的應(yīng)用前景，可以高效介導(dǎo)多基因、大片段基因的共表達(dá)。

6dEB在大腸桿菌中的成功合成意義重要，可以認(rèn)為是紅霉素基因工程研究的一個轉(zhuǎn)折點。至 2001年 Pfeifer等[9]在大腸桿菌中異源合成6dEB以來，紅霉素基因工程的研究有了迅猛的發(fā)展。在提高6dEB 合成產(chǎn)量方面，Lau等[15]采用高細(xì)胞密度分批發(fā)酵的方法，用優(yōu)化的培養(yǎng)基使6dEB的產(chǎn)量上升至1.1 g/L；另有一些研究者在基因的表達(dá)調(diào)控方面進(jìn)行了探索，均大幅度提高了 6dEB 在大腸桿菌中的合成產(chǎn)量[16-17]。在6dEB后修飾的研究中，Peiru等[11]和 Lee等[18]分別選取來源于其他鏈霉菌中的糖基化基因，構(gòu)建了6dEB的后修飾通路，以6dEB 為底物在大腸桿菌中異源合成了Ery D和6dEry D等；2010年P(guān)feifer等[19]將紅霉素鏈霉菌基因組中參與紅霉素糖基化的18個基因克隆于3個不同抗性的質(zhì)粒中，以6dEB為底物合成了Ery A。此外，Menzella等[20]合成了紅霉素PKS基因序列，通過改造和替換PKS中的模塊，合成了非天然的天然產(chǎn)物。

本研究完成了6dEB合成通路在大腸桿菌中的重建，建立了紅霉素大環(huán)內(nèi)酯改造和修飾的平臺，也為之后紅霉素合成通路在大腸桿菌中的完整重建以及聚酮類抗生素的組合性生物合成奠定了堅實的基礎(chǔ)。

致謝：感謝軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒藥物研究所王好山和張誠老師在質(zhì)譜檢測方面的幫助和指導(dǎo)；感謝軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所吳軍研究員和張惟材研究員為本實驗提供了低溫誘導(dǎo)條件！

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