劉彬，可金星，蔡紹皙，李校堃，張路，陳文琦1,,5，張耀光

1 淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715

2 第三軍醫(yī)大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，重慶 400030

3 重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶 400030

4 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物反應(yīng)器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心，吉林 長春 130118

5 西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶 400715

周圍神經(jīng)缺損替代修復(fù)是一個(gè)復(fù)雜且難度較高的問題，生物組織工程支架是解決這一難題的有效途徑。材料問題一直是神經(jīng)支架所面臨的重要問題之一，很多材料都被應(yīng)用這一領(lǐng)域的研究中[1-8]。單一材料在體現(xiàn)其優(yōu)勢的同時(shí)，通常也體現(xiàn)出一些缺陷，因此采用多種材料制備復(fù)合材料作為神經(jīng)支架以促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷修復(fù)，是目前普遍認(rèn)可的方法。新鮮豬皮中水分含量為55.5%，脂肪含量為13.56%，豬皮中的膠原含量約為24.35%，其余部分主要為細(xì)胞內(nèi)容物[9]。以豬皮為原料制備細(xì)胞外基質(zhì) (ECM) 的實(shí)質(zhì)是去除脂肪和具有免疫原性的細(xì)胞內(nèi)容物。豬皮來源的ECM主要由膠原構(gòu)成，除此之外還含有層粘連蛋白、纖維結(jié)合蛋白等有益于神經(jīng)再生的物質(zhì)，具有良好的生物相容性[1]。其中，膠原為三股螺旋結(jié)構(gòu)，α1和α2鏈的分子量約為100 kDa，β鏈的分子量約為200 kDa，變性溫度為37.5 ℃。膠原分子主要包含甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸，不含色氨酸和胱氨酸[9-10]。豬皮在厚度及其面積方面的優(yōu)勢決定了豬皮來源的ECM更易于加工成神經(jīng)支架所需要的形態(tài)。NGF在神經(jīng)損傷修復(fù)中的作用得到了廣泛的認(rèn)同，但是，NGF緩釋體系的合理性直接決定了NGF功能的發(fā)揮[1]。在以豬皮來源的ECM制備對NGF具有緩釋功能的神經(jīng)支架的過程中，需要一種包封劑。PLGA良好的生物相容性及其生物可降解性等性質(zhì)，都表明它適合作為這種包封劑。PLGA在體內(nèi)降解過程中，會釋放弱酸性物質(zhì)，從而為組織環(huán)境pH的穩(wěn)定造成一定的壓力[11]，本研究擬采用一種弱堿性物質(zhì)，即賴氨酸[12-13]來克服這一問題。

本研究以豬皮為原料制備 ECM，用 PLGA將NGF和賴氨酸復(fù)合在ECM上，以構(gòu)建一種對NGF具有緩釋功能，并可以在一定程度上中和PLGA酸性降解產(chǎn)物的復(fù)合材料。通過形態(tài)學(xué)觀察、力學(xué)測試、降解試驗(yàn)、細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)，在體外評價(jià)其作為神經(jīng)支架的可行性。由于本材料僅供體外測試使用，故其形態(tài)未與周圍神經(jīng)的幾何形態(tài)相匹配。

1 材料與方法

1.1 豬皮來源ECM的制備與觀測

取豬肩背部新鮮豬皮，去毛，溫水清洗，切割成條狀 (2 mm×2 mm×100 mm)，用NaOH溶液脫脂，用NaCl進(jìn)行高滲透壓處理，用純凈水進(jìn)行低滲透壓處理，用胰蛋白酶 (Sigma公司)破壞細(xì)胞成分、細(xì)胞連接，疏松膠原，用5 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) +2%TritonX- 100中在37 ℃下振蕩浸泡3 d，室溫下用清水沖洗2 d，用Trix-100 (Sigma公司) 進(jìn)行去垢處理，純凈水漂洗；用冷凍干燥機(jī) (Flexi-Dry μP，F(xiàn)TSSYSTEM，USA) 脫水；分別進(jìn)行掃描電子顯微鏡 (AMRAY 1000B，USA) 和 HE染色觀測去細(xì)胞效果以及內(nèi)部形態(tài)[14]。

1.2 NGF明膠微球的制備

在明膠 (Bloom strength，225；pI：4.7；Sigma)水溶液中加入NGF (?-NGF，Human，Sigma)，加入植物油 (37 ℃) 乳化，冷凍到?20 ℃，在冷凍離心機(jī)中分離，沉淀物用丙酮洗滌，除去植物油和水，冷凍干燥，篩分備用 (400目)[15-20]。

1.3 神經(jīng)支架的制備

將NGF明膠微球、賴氨酸、豬皮來源ECM置于3% (W/V) PLGA (8020 mole ratio of lactide to glycolide；Sigma) 的二氯甲烷溶液中，振蕩混合后，負(fù)壓抽干。

1.4 內(nèi)部形態(tài)觀察及孔隙率測定

用掃描電子顯微鏡 (AMRAY 1000B，USA)觀察神經(jīng)支架的表面及斷面的形態(tài)；用文獻(xiàn)報(bào)道的方法測定孔隙率和密度[21]。

1.5 力學(xué)測試

用材料力學(xué)測試機(jī) (INSTRON 1011，USA)檢測神經(jīng)支架的力學(xué)性質(zhì) (加載速度為10 mm/min)。

1.6 體外降解測試

取神經(jīng)支架 (300±1) mg (以豬皮來源ECM和 PLGA為對照)，置于安培瓶中，分別加入10 mL三蒸水或PBS (Sigma公司)，置于搖床(50 r/min) 在生化培養(yǎng)箱 (37 ℃) 中持續(xù)處理8周，期間不更換降解液，每周取樣1次。用pH計(jì) (DELTA320) 在各時(shí)間點(diǎn)檢測降解液pH值。在前4周分別稱量各樣品的濕重和干重 (經(jīng)冷凍干燥)，稱重后將樣品重新放回原降解液中。對于進(jìn)行SEM觀察的樣品做相同的處理。

1.7 對NGF的持續(xù)釋放作用

取50 mg神經(jīng)支架，加入10 mL PBS，置于搖床 (40 r/min) 在生化培養(yǎng)箱 (37 ℃) 中持續(xù)處理30 d每次取樣1 mL，同時(shí)回加1 mL新鮮的PBS。期間，在起始12 h中，每間隔2 h取樣1次，在此后的2 d內(nèi)，每12 h取樣1次，之后，每天取樣1次。對各樣品進(jìn)行?70 ℃保存。待全部取樣完成后，統(tǒng)一用β-NGF (human) ELISA kit (Sigma) (按試劑盒使用說明書) 對各樣品進(jìn)行處理。神經(jīng)支架對NGF的累計(jì)釋放率的計(jì)算公式為：

1.8 雪旺氏細(xì)胞在神經(jīng)支架上的粘附與增殖

雪旺氏細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與純化，及 MTT法均參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行[22-23]。在神經(jīng)支架與雪旺氏細(xì)胞共培養(yǎng)15 d后，取出材料進(jìn)行SEM觀察。

2 結(jié)果

2.1 豬皮來源ECM觀察

蘇木精-伊紅 (HE) 染色，是一種傳統(tǒng)而經(jīng)典的組織學(xué)方法，可以將細(xì)胞核物質(zhì)染成紫色，將其余物質(zhì)染成粉紅色。從圖1可以看出，新鮮豬皮 (圖1A) 相對致密，其中零星分布著一些細(xì)胞，ECM (圖1B) 較為疏松，無細(xì)胞。這可以說明本研究中所使用的 ECM 實(shí)現(xiàn)了去細(xì)胞的目的。SEM觀察結(jié)果顯示，與新鮮豬皮 (圖1C) 相比，ECM (圖1D) 中膠原纖維的排列較為疏松，纖維的直徑為1~10 μm左右，纖維間縫隙的寬度為5~50 μm左右，這就為制備內(nèi)部具有相互聯(lián)通的蜂窩狀結(jié)構(gòu)的神經(jīng)支架提供了充分的前提條件，同時(shí)也為NGF 明膠微球進(jìn)入其內(nèi)部以構(gòu)建NGF緩釋體系創(chuàng)造了條件。

2.2 神經(jīng)支架的形態(tài)和結(jié)構(gòu)

本神經(jīng)支架的孔隙率為 68.3%~81.2%，密度為0.62~0.68 g/cm3?？障堵适巧窠?jīng)支架的重要指標(biāo)之一。但是并不能直接地用于評價(jià)神經(jīng)支架的優(yōu)劣。因?yàn)橹Ъ軆?nèi)部孔隙的大小、相互間的連通性、均質(zhì)程度，才與雪旺氏細(xì)胞和軸突是否能夠順利地在支架內(nèi)部穿行和進(jìn)行物質(zhì)交換直接相關(guān)。同時(shí)，在支架的降解過程中，以及在巨噬細(xì)胞的吞噬過程中，支架內(nèi)部會有新的空隙形成。再者，過高的孔隙率意味著支架質(zhì)地過于疏松，會導(dǎo)致質(zhì)地脆弱，難以耐受移植過程中的手術(shù)操作，以及術(shù)后的組織壓迫和牽拉。所以，孔隙率的指標(biāo)需要與支架的力學(xué)性質(zhì)及內(nèi)部結(jié)構(gòu)相結(jié)合，以評價(jià)神經(jīng)支架形態(tài)的合理性。

SEM觀察顯示，PLGA在神經(jīng)支架表面 (圖2A) 形成膜狀結(jié)構(gòu)，同時(shí)在表面形成一系列分布較為均勻的直徑介于1~5 μm的孔隙。這些孔隙主要是在材料制備過程中，在負(fù)壓作用下由溶質(zhì)揮發(fā)所形成的。這種尺度的孔隙允許神經(jīng)支架內(nèi)部橫向就近與組織環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換，但細(xì)胞無法通過。這種結(jié)構(gòu)或許可以改善神經(jīng)損傷修復(fù)中，移植體內(nèi)部與組織環(huán)境間的物質(zhì)交換問題，這無疑會有益于軸突的再生。細(xì)胞無法在這些孔隙中通過，對軸突的有序生長是有益的。因此本神經(jīng)支架的表面形態(tài)符合神經(jīng)再生的要求。

神經(jīng)支架的斷面 (圖2B) 很難發(fā)現(xiàn)ECM中的膠原纖維，這表明PLGA已經(jīng)滲入ECM內(nèi)部，并在孔隙內(nèi)表面形成膜狀結(jié)構(gòu)，由此推測，NGF明膠微球和賴氨酸也被 PLGA包封起來從而形成一種有效的NGF、賴氨酸緩釋體系。斷面 (圖2B) 中可以觀察到直徑為8 μm左右的圓球狀顆粒，這是完整的NGF明膠微球。還可以觀察到直徑為0.5 μm左右的粉末狀顆粒，它們可能是明膠微球在支架加工成型過程中崩解所造成的。這些粉末可能是 NGF、明膠、賴氨酸的混合物。不過，仍有理由相信，它們也被 PLGA在表面進(jìn)行了輕度的覆蓋。它們的存在可能會導(dǎo)致支架在降解的早期對NGF暴釋。在支架的斷面 (圖2B) 中體現(xiàn)出了眾多遠(yuǎn)大于10 μm的孔隙，這為雪旺氏細(xì)胞及軸突的侵入提供了足夠的內(nèi)部空間。

2.3 力學(xué)性質(zhì)

材料的力學(xué)性質(zhì)也是神經(jīng)支架的重要性質(zhì)之一。在移植過程中需要耐受手術(shù)操作而保持形態(tài)，在移植后也需要耐受肌肉收縮等原因所導(dǎo)致的拉伸和擠壓。豬皮來源的ECM主要由于膠原纖維構(gòu)成，具有很好的機(jī)械強(qiáng)度。PLGA具有較好的剛性。在ECM和PLGA所組成的復(fù)合材料中，韌性主要由膠原所決定，硬度由PLGA決定。二者的含量以及混合的均勻程度都會導(dǎo)致復(fù)合材料力學(xué)性質(zhì)的變化。本神經(jīng)支架的斷裂強(qiáng)度為8.308 MPa，斷裂伸長率為38.98%，彈性模量為97.27 MPa. 這說明其強(qiáng)度高，具有一定的彈性，硬度適中。

圖1 新鮮豬皮與豬皮來源的ECM的內(nèi)部形態(tài)Fig. 1 Morphology of fresh pigskin and acellular pigskin. (A) Fresh pigskin (HE staining). (B) ECM (HE staining). (C) Fresh pigskin (SEM). (D) ECM (SEM).

圖2 神經(jīng)支架的形態(tài)Fig. 2 Structure of the scaffold (SEM). (A) Surface. (B) Cross section.

2.4 降解性質(zhì)

在PBS中降解4周后發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)支架的最大吸水率為126%，最大失重率為43.3%，而對照組豬皮來源的ECM的最大吸水率為300%，最大失重率為9.9% (圖3)。支架中的PLGA逐步降解，在第4周時(shí)幾乎僅剩下ECM的成分 (圖4)。這表明此時(shí)的支架應(yīng)該已經(jīng)不具備對 NGF和賴氨酸的持續(xù)釋放功能，如果希望要延長這樣的過程，則在支架的制備中需要增加PLGA的含量。在8周的考察期中 (圖5)，降解液中的pH體現(xiàn)出了一個(gè)逐步緩慢降低的趨勢，相對于對照組 (PLGA) 而言，支架組的pH 降低的趨勢較為平緩。這表明賴氨酸在支架中的添加能中和PLGA降解過程中所釋放的弱酸性物質(zhì)，以穩(wěn)定環(huán)境pH。賴氨酸的釋放應(yīng)該在4周左右結(jié)束 (圖4D)，但是，在4~8周的降解過程中 (圖5)，支架組降解液的pH仍略高于對照組 (PLGA)，這或許是豬皮來源ECM的降解性質(zhì)所決定的。

2.5 支架對NGF的緩釋性質(zhì)

支架對NGF的緩釋曲線 (圖6) 顯示，在第1天屬于NGF的暴釋期，累積釋放量占整個(gè)考察期 (30 d) 累積釋放率 (38%) 的40%左右。在開始1周的累積釋放量占考察期 (30 d) 累積釋放率 (38%) 的60%左右。

2.6 雪旺氏細(xì)胞在神經(jīng)支架上的粘附與增殖

將支架與雪旺氏細(xì)胞共培養(yǎng)7 d，以單獨(dú)培養(yǎng)的雪旺氏細(xì)胞作為對照 (Control)，同時(shí)在另一實(shí)驗(yàn)組中一次性添加NGF。結(jié)果 (圖7) 顯示，在各組中雪旺氏細(xì)胞的增殖趨勢相同，但是仍體現(xiàn)出細(xì)胞數(shù)量的不同。細(xì)胞增殖速度由低到高的排列順序依次為：對照組、支架組、單獨(dú)添加NGF組。這一結(jié)果表明支架中NGF保持了生物活性。將支架與雪旺氏細(xì)胞通過15 d的共培養(yǎng)，能夠觀察到雪旺氏細(xì)胞在支架表面的粘附 (圖8)。

圖3 神經(jīng)支架質(zhì)量的殘留率 (失重率)Fig. 3 Weight remaining of the scaffolds and PLGA.

圖4 支架在降解過程中的形態(tài)變化Fig. 4 Changes of the scaffold surface during degradation in PBS solution. (A) 1 week. (B) 2 weeks. (C) 3 weeks. (D) 4 weeks.

圖5 支架在水中降解的過程中環(huán)境pH的變化Fig. 5 Changes of pH value in degradation solution.

圖6 支架對NGF的緩釋作用Fig. 6 NGF release ratio of the scaffold.

圖7 雪旺氏細(xì)胞的MTT試驗(yàn)Fig. 7 MTT assay of schwan cells.

圖8 雪旺氏細(xì)胞在支架表面的粘附Fig. 8 Schwann cell adhering to the scaffold.

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，本研究所制備的復(fù)合材料具有如下性質(zhì)：適宜的強(qiáng)度、彈性和硬度；內(nèi)部蜂窩狀結(jié)構(gòu)；易降解；對NGF的緩釋功能；保持了NGF的生物活性；對PLGA降解過程中所產(chǎn)生的酸性物質(zhì)具有一定的中和作用；對雪旺氏細(xì)胞有較好的親和性。這些性質(zhì)都是神經(jīng)支架所需要滿足的條件，因此有望成為一種新型的促周圍神經(jīng)損傷修復(fù)支架。

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