陳欣，劉龍，李江華，劉杰，堵國(guó)成，陳堅(jiān)

1 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122

2 江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122

3 江蘇江山制藥有限公司，江蘇 靖江 214500

4 江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122

氨基葡萄糖 (Glucosamine，2-amino-2-deoxy-D-glucose，GlcN) 又稱氨基葡糖或葡糖胺，是葡萄糖的一個(gè)羥基被氨基取代后的化合物[1-4]，在保健食品和醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用，如能特異性地作用于關(guān)節(jié)軟骨，有效治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；可抑制白血病細(xì)胞K562的生長(zhǎng)；可參與肝腎解毒，發(fā)揮抗炎、護(hù)肝的作用等[5-7]。在日本和美國(guó)，GlcN作為食品配料廣泛應(yīng)用。但令人遺憾的是，目前國(guó)內(nèi)上市的GlcN產(chǎn)品還比較少，相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)空間和潛力巨大。GlcN的生產(chǎn)方法可分為3種：甲殼素水解法、生物轉(zhuǎn)化法[8-9]和微生物發(fā)酵法[1-4]。甲殼素水解是目前生產(chǎn)GlcN的主要方法，但原料來(lái)源受限、環(huán)境污染嚴(yán)重、部分消費(fèi)者服用后會(huì)過(guò)敏；生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)的酶的價(jià)格高、生產(chǎn)成本高，轉(zhuǎn)化時(shí)間長(zhǎng)，難于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)[1-4,10-11]；因此微生物發(fā)酵生產(chǎn)GlcN吸引了越來(lái)越多研究者的關(guān)注[12-14]。相對(duì)于水解法和生物轉(zhuǎn)化法，微生物發(fā)酵法具有以下優(yōu)點(diǎn)：1) 發(fā)酵時(shí)間較短，生產(chǎn)強(qiáng)度較高；2) 原料來(lái)源不受地域和季節(jié)限制，產(chǎn)品無(wú)魚(yú)腥味；3) 對(duì)環(huán)境污染小；4) 產(chǎn)品來(lái)自微生物，消費(fèi)者服用后不會(huì)出現(xiàn)過(guò)敏。但目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于 GlcN發(fā)酵生產(chǎn)的研究寥寥無(wú)幾。

對(duì)大腸桿菌中 GlcN合成代謝途徑的研究[1,4,15-16]表明：進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖在磷酸葡萄糖異構(gòu)酶 (PGI) 的催化下轉(zhuǎn)化成6-磷酸葡萄糖，后者在氨基葡萄糖合成酶 (GlmS) 催化下生成GlcN，氨基葡萄糖乙?；?(Gna1) 催化 GlcN轉(zhuǎn)化成乙酰氨基葡萄糖 (GlcNAc) (圖1)。本研究室通過(guò)在大腸桿菌 Escherichia coli ATCC 25947中過(guò)量表達(dá)氨基葡萄糖合成酶 (由基因glmS編碼) 和氨基葡萄糖乙?；?(由基因gna1編碼)，成功構(gòu)建了一株可高效合成氨糖的重組大腸桿菌E. coli-glms-gna1。通過(guò)乙酰化將GlcN轉(zhuǎn)化為GlcNAc可顯著降低GlcN對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝的抑制作用，在下游純化過(guò)程中用弱酸處理即可將GlcNAc脫乙酰獲得最終產(chǎn)品GlcN，因此，GlcN和GlcNAc都是本文中的目標(biāo)發(fā)酵產(chǎn)物。但前期的研究發(fā)現(xiàn)[4]，由于 GlcN依靠甘露糖磷酸轉(zhuǎn)移系統(tǒng) (Mannose PTS，ⅡMan，由manXYZ操縱子編碼) 和葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(glucose PTS，ⅡGlc，由pstG基因編碼) 對(duì)其進(jìn)行磷酸化后從胞外向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，GlcNAc依靠ⅡMan和乙酰氨基葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移系統(tǒng) (GlcNAc PTS，ⅡNAG，由基因nagE編碼) 對(duì)其進(jìn)行磷酸化后從胞外向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致氨糖產(chǎn)量降低。因此，要想在胞外積累高濃度的GlcN或GlcNAc，就必須減弱或阻斷GlcN或GlcNAc從胞外到胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)。manXYZ操縱子由X、Y、Z三個(gè)基因構(gòu)成，其中manX基因編碼甘露糖特異性磷酸轉(zhuǎn)移復(fù)合酶的組分ⅡA和ⅡB蛋白，manX基因的缺失對(duì)甘露糖特異性磷酸轉(zhuǎn)移復(fù)合酶活性影響較大，通過(guò)敲除nagE和manX基因，有望阻止胞外GlcN或GlcNAc向胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而增加產(chǎn)量[17-18]。

近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的依賴λ噬菌體的Red重組系統(tǒng)，可以直接利用含同源臂的PCR線性片段，替換出同源臂內(nèi)的目的基因。該系統(tǒng)利用λ噬菌體3個(gè)蛋白質(zhì)Exo、Bet和Gam，Cam抑制大腸桿菌的RecBCD核酸外切酶V的活性，使外源線性DNA不會(huì)立即被降解，Exo和Bet引導(dǎo)線性片段與同源區(qū)發(fā)生重組置換，而且效率較傳統(tǒng)的同源重組方法高幾十倍[19-20]。我們從基因突變菌株中通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增出突變基因及其兩翼 DNA片段，利用該系統(tǒng)替代 E. coli-glms-gna1中相應(yīng)基因，構(gòu)建了 nagE及manX缺失的大腸桿菌工程菌株，使其喪失氨基葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移功能，以此增加胞外氨糖產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

E. coli-glms-gna1：本實(shí)驗(yàn)保藏，將來(lái)自大腸桿菌 E. coli基因組的氨基葡萄糖合成酶基因(glmS) 和氨基葡萄糖乙酰化酶基因 (gna1) 通過(guò)pET-28 (a) 在E. coli ATCC 25947 (DE3) 中進(jìn)行了克隆和表達(dá)而獲得；E. coli JW0665-1 (F-，?(araD-araB) 567， ?lacZ4787 (::rrnB-3)，?nagE728::kan，lambda-，rph-1，? (rhaD-rhaB) 568，hsdR514)；E. coli JW1806-1 (F-，?(araD-araB) 567，ΔlacZ4787 (::rrnB-3)，lambda-，ΔmanX741::kan，rph-1，? (rhaD-rhaB) 568，hsdR514)，用于提供被卡那霉素抗性基因 (Kanr)插入失活的nagE及manX片段，購(gòu)自美國(guó)耶魯大學(xué)菌種保藏中心；質(zhì)粒pKD46和pCP20購(gòu)自美國(guó)耶魯大學(xué)菌種保藏中心。

1.1.2 酶和試劑

胰蛋白胨和酵母粉購(gòu)自 Oxoid公司；LA DNA聚合酶和 PCR產(chǎn)物回收試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司 (大連)；卡那霉素、氨芐青霉素、引物合成、L-阿拉伯糖和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于Sangon生工生物工程 (上海) 有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器

電轉(zhuǎn)化儀 (GenePulser Xcell)，Bio-Rad公司；臺(tái)式高速離心機(jī)，日本Hitech公司；DYY-6C型電泳儀，北京六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad公司；PCR儀，Bio-Rad公司；7 L發(fā)酵罐 (NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC，G107-09)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：酵母膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，瓊脂20 g，定容至1 L，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10.0% (W/V)，蛋白胨1.2% (W/V)，酵母膏 2.4% (W/V)，甘油 0.4% (V/V)，KH2PO417 mmol/L，K2HPO472 mmol/L。

圖1 大腸桿菌中氨基葡萄糖合成途經(jīng)Fig. 1 Biosynthetic pathways of glucosamine in E. coli. Glc: glucose; Fru-6-P: fructose-6-P; ptsG: glucose transporter gene; GlcN-6-P: glucosamine-6-P; GlcNAc-6-P: N-acetylglucosamine-6-P; glmS: glucosamine synthase; gna1: glucosamine-6-phosphate acetyltransferase; nagE: GlcNAc-specific transporter gene; manXYZ: mannose transporter gene; OUT: outside the cell; IN: inside the cell.

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)E. coli JW0665 nagE基因上下游800 bp設(shè)計(jì)引物NU和ND，擴(kuò)增得到3.5 kb的突變序列；根據(jù)E. coli JW1806-1 manX基因上下游500 bp序列設(shè)計(jì)引物MU和MD，擴(kuò)增得到2.3 kb的突變序列，同時(shí)根據(jù)kanr內(nèi)部序列設(shè)計(jì)鑒定引物K1和K2，用于對(duì)轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證 (表1)。

1.2.3 感受態(tài)細(xì)胞制備

從30 ℃培養(yǎng)16~20 h的平板中挑取一個(gè)單菌落，轉(zhuǎn)接到含20 mL LB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于 30 ℃下 200 r/min培養(yǎng)過(guò)夜，按0.5%的接種量轉(zhuǎn)接含有50 mL LB培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，于30 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600≈0.6，將三角瓶置于冰中預(yù)冷 30 min，于超凈臺(tái)內(nèi)將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的 50 mL無(wú)菌離心管中，冰上放置10 min；4 ℃、4 000 r/min離心10 min；棄上清，加入少量預(yù)冷的無(wú)菌水重懸菌體，4 ℃、4 000 r/min離心10 min；重復(fù)1次無(wú)菌水洗菌體；最后用預(yù)冷的 10%甘油洗滌 1次，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，棄上清，將菌體懸浮于0.8 mL 10%的甘油中，按每管50 μL感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行分裝，或保存于?80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

制備用于同源重組的 E. coli JW0665-1 (pKD46) 或E. coli JW1605-1 (pKD46) 感受態(tài)細(xì)胞時(shí)，當(dāng)菌液OD600≈0.2時(shí)加入1 mmol/L的L-阿拉伯糖誘導(dǎo)Red重組酶表達(dá)，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)至菌液最終OD600≈0.6，其他操作同上。

1.2.4 電轉(zhuǎn)化

取出感受態(tài)細(xì)胞，在冰浴中融化；加入待轉(zhuǎn)化的1~2 μL DNA或1 μL pKD46或pCP20，用粗口吸頭輕柔混合；將上述混合物轉(zhuǎn)入預(yù)冷的0.2 cm電轉(zhuǎn)杯中，冰浴中預(yù)冷10 min；打開(kāi)電轉(zhuǎn)儀，將參數(shù)設(shè)定為2 500 V，25 mF，200 ?，電擊時(shí)間約為5 ms；從冰中取出電轉(zhuǎn)杯，用紙巾吸去表面的水分，放入樣品槽中；電擊后立即加入1 mL LB培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)1.5 h后將轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞涂布在含有抗生素的LB平板上于30 ℃培養(yǎng)進(jìn)行篩選。擴(kuò)增片段轉(zhuǎn)化含有 pKD46的感受態(tài)細(xì)胞時(shí)，電轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)條件為30 ℃培養(yǎng)1.5 h，然后升溫至42 ℃培養(yǎng)12~16 h以去除pKD46；利用pCP20消除轉(zhuǎn)化子中kanr時(shí)，電轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)條件為30 ℃培養(yǎng)2 h，然后升溫至42 ℃培養(yǎng) 12~16 h以去除pCP20。

1.2.5 轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證

將電轉(zhuǎn)化后長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子分別用 NU/ND、 MU/MD及鑒定引物K1/K2進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證(表2)，考察nagE和manX基因是否已被kanr基因替換。

1.2.6 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

在7 L發(fā)酵罐中配制發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量為4 L，接入E. coli-glms-gna1、E. coli-glms-gna1-?nagE和E. coli-glms-gna1-?nagE-?manX，接種后37 ℃、400 r/min培養(yǎng)，通氣量240 L/h，至OD600達(dá)到0.6 (約4 h)，加入乳糖 (其在發(fā)酵罐中的濃度為5 g/L)，誘導(dǎo)重組質(zhì)粒pET28 (a)-glms-gna1中g(shù)lmS和gna1基因表達(dá)，繼續(xù)發(fā)酵至20 h。于接種后6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h進(jìn)行生物量、GlcN和GlcNAc產(chǎn)量的分析。

1.2.7 生物量、GlcN和GlcNAc的檢測(cè)方法

生物量采用干重法測(cè)定。GlcN的檢測(cè)參考Elson-Morgan法[4,21]：取發(fā)酵液5.0 mL加入5 mL離心管中，8 000 r/min離心8 min，取0.5 mL離

心上清液加入乙酰丙酮試劑1.0 mL，90 ℃水浴處理1 h，冷卻至室溫，慢慢加入96% (V/V) 乙醇10 mL，然后加入DMAB試劑1.0 mL，混合均勻?；旌虾笫覝胤胖? h，530 nm處比色，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算GlcN產(chǎn)量。GlcNAc用HPLC方法檢測(cè)[22]，Agilent 1200，RID檢測(cè)器，Alltech C18柱(250×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相：70%乙腈，流速0.7 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積為10 μL。

表1 本實(shí)驗(yàn)中使用的PCR系列引物Table 1 PCR primers used in this work

表2 轉(zhuǎn)化子菌落PCR反應(yīng)中使用的引物、模板、退火溫度及產(chǎn)物大小Table 2 Primer pairs, templates and annealing temperature used for the transformant colony PCR and the size of PCR products

2 結(jié)果與分析

2.1 卡那抗性基因替代nagE及manX基因

利用引物NU/ND從E. coli JW0665-1中擴(kuò)增出的 DNA片段，通過(guò) Red重組替代 E. coliglms-gna1基因組nagE基因，轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證結(jié)果如圖2所示。泳道2為E. coli-glms-gna1- ?nagE::kan菌落PCR產(chǎn)物，大小為2 923 bp，泳道3為原菌株E. coli-glms-gna1菌落PCR產(chǎn)物，大小為3 547 bp，利用鑒定引物NU/K2和K1/ND分別對(duì) E. coli-glms-gna1、E. coli JW0665-1和 E. coli-glms- gna1-?nagE::Kan進(jìn)行菌落PCR，泳帶4和8為對(duì)照，無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道5、6、7中條帶大小均為1 649 bp，泳道9、10中條帶大小均為1 662 bp，說(shuō)明攜帶kanr基因的PCR擴(kuò)增片段已經(jīng)替代了nagE基因，得到nagE基因插入失活的菌株E. coli-glms-gna1- ?nagE::kan。

圖2 E. coli-glms-gna1-?nagE::kan菌落PCR電泳結(jié)果Fig. 2 Colony PCR products of E. coli-glms-gna1-?nagE::kan. 1: DL 5 000 DNA marker; 2: colony PCR products of E. coli-glms-gna1-?nagE::kan amplified by primers NU and ND (2 923 bp); 3: colony PCR products of E. coli-glms-gna1 amplified by primers NU and ND (3 547 bp); 4: colony PCR products of E. coli-glms-gna1 amplified by primers K1 and ND; 5: colony PCR products of E. coli JW0665-1 amplified by primers K1 and ND (1 649 bp); 6, 7: colony PCR products of E. coli-glms-gna1-?nagE::kan amplified by primers K1 and ND (1 649 bp); 8: colony PCR products of E. coli-glms-gna1 amplified by primers NU and K2; 9: colony PCR products of E. coli JW0665-1 amplified by primers NU and K2 (1 662 bp); 10: colony PCR products of E. coli-glms-gna1- ?nagE::kan amplified by primers NU and K2 (1 662 bp); 11: DL 2000 DNA marker.

利用引物 MU/MD從 E. coli JW1806-1中擴(kuò)增出的 DNA片段，通過(guò) Red重組替代E. coli-glms-gna1-?nagE基因組manX基因。轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證結(jié)果如圖3所示，泳道1和2為E. coli-glms-gna1-?nagE菌落PCR產(chǎn)物，大小為2 923 bp，泳道3、4分別為菌株E. coli JW1806-1和 E. coli-glms-gna1-?nagE-?manX::Kan菌落PCR產(chǎn)物，大小為3 547 bp，利用鑒定引物NU/K2和K1/ND分別對(duì)E. coli-glms-gna1-?nagE、E. coli JW1806-1和E. coli-glms-gna1-?nagE-manX::Kan進(jìn)行菌落PCR，泳道5和8為對(duì)照，無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道6、7條帶大小均為1 344 bp，泳道9、10條帶大小均為 1 383 bp，說(shuō)明攜帶 kanr基因的PCR擴(kuò)增片段已經(jīng)替代了manX基因。

2.2 卡那抗性基因的去除

將質(zhì)粒 pCP20轉(zhuǎn)化 E. coli-glms-gna1-?nagE::kan，去除kanr，驗(yàn)證結(jié)果如圖4所示。泳道1、2為E. coli-glms-gna1-?nagE菌落PCR產(chǎn)物，大小為1 699 bp，泳道3、4分別為E. coli JW0665-1和 E. coli-glms-gna1-?nagE::kan菌落PCR產(chǎn)物，大小為2 923 bp，泳道5為E. coli-glmsgna1落PCR產(chǎn)物，大小為3 547 bp，說(shuō)明kanr已經(jīng)從轉(zhuǎn)化子中去除。

將質(zhì)粒pCP20轉(zhuǎn)化E. coli-glms-gna1-?nagE-?manX::kan，去除kanr，得到E. coli-glms-gna1-?nagE-?manX，驗(yàn)證結(jié)果如圖5所示。泳道1、2為E. coli-glms-gna1-?nagE-?manX菌落PCR產(chǎn)物，大小為 1 113 bp，泳道 3、4分別為 E. coli-glms-gna1-?nagE::kan和E. coli JW1806-1菌落PCR產(chǎn)物，大小為2 337 bp，說(shuō)明kanr已經(jīng)從轉(zhuǎn)化子中去除。

圖3 E. coli-glms-gna1-?nagE-?manX::kan菌落PCR電泳結(jié)果Fig. 3 Colony PCR products electrophoresis analysis result of E. coli-glms-gna1-?nagE-?manX::kan. 1, 2: colony PCR products of E. coli-glms-gna1-?nagE amplified by primers MU and MD (1 986 bp); 3: colony PCR products of E. coli JW1806-1 amplified by primers MU and MD (2 337 bp); 4: colony PCR products of E. coli-glms-gna1-?nagE-?manX::kan amplified by primers MU and MD (2 337 bp); 5: colony PCR products of E. coli-glms-gna1 amplified by primers K1 and MD; 6: colony PCR products of E. coli JW1806-1 amplified by primers K1 and MD (1 344 bp); 7: colony PCR products of E. coli-glms-gna1-?nagE-?manX::kan amplified by primers K1 and MD (1 344 bp); 8: colony PCR products of E. coli-glms-gna1 amplified by primers MU and K2; 9: colony PCR products of E. coli JW1806-1 amplified by primers MU and K2 (1 383 bp); 10: colony PCR products of E. coli-glms-gna1-?nagE-?manX::kan amplified by primers MU and K2 (1 383 bp); 11: DL 10 000 DNA marker.

圖4 E. coli-glms-gna1-?nagE菌落PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig. 4 Colony PCR products electrophoresis analysis result of E. coli-glms-gna1-?nagE. 1, 2: colony PCR products of E. coli-glms-gna1-?nagE amplified by primers NU and ND (1 699 bp); 3: colony PCR products of E. coli JW0665-1 amplified by primers NU and ND (2 923 bp); 4: colony PCR products of E. coli-glms-gna1- ?nagE::kan amplified by primers NU and ND (2 923 bp); 5: colony PCR products of E. coli-glms-gna1 amplified by primers NU and ND (3 547 bp); 6: DL 10 000 DNA marker.

圖5 E. coli-glms-gna1-?nagE-?manX菌落PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig. 5 Colony PCR products electrophoresis analysis result of E. coli-glms-gna1-?nagE-?manX. 1, 2: colony PCR products of E. coli-glms-gna1-?nagE-?manX amplified by primers MU and MD (1 113 bp); 3: colony PCR products of E. coli-glms-gna1- nagE-?manX::kan amplified by primers MU and MD (2 337 bp); 4: colony PCR products of E. coli JW1806-1 amplified by primers MU and MD (2 337 bp); 5: DL 2 000 DNA marker.

2.3 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 E. coli-glms-gna1-?nagE發(fā)酵結(jié)果

從圖 6和表 3可以看出，E. coli-glmsgna1-?nagE和對(duì)照菌株E. coli-glms-gna1的菌濃在 14 h時(shí)均達(dá)到最高值，分別為 5.42 g/L和4.68 g/L，說(shuō)明nagE基因的敲除對(duì)與細(xì)胞膜合成相關(guān)的物質(zhì)的代謝未造成較大影響，細(xì)胞用于合成細(xì)胞膜的前體物質(zhì)GlcNAc可通過(guò)manX等基因編碼產(chǎn)物將GlcN轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)而得到補(bǔ)償，這可以從發(fā)酵前期12 h內(nèi)E. coli-glms-gna1-?nagE的比生長(zhǎng)速率較對(duì)照菌株高看出。

圖6 E. coli-glms-gna1-?nagE發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig. 6 Results of GlcN and GlcNAc production by E. coli-glms-gna1-?nagE.

在發(fā)酵過(guò)程中，就GlcN產(chǎn)量而言，E. coliglms-gna1-?nagE在12 h達(dá)到最大值4.38 g/L，隨后呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)，這可能是因?yàn)閚agE基因的敲除主要抑制GlcNAc向胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)碳源的需求導(dǎo)致GlcN能依靠ptsG編碼的酶ⅡCBGlc而進(jìn)入細(xì)胞，而對(duì)照菌株在 12 h時(shí)GlcN產(chǎn)量達(dá)到最高值 4.06 g/L，E. coli-glmsgna1-?nagE的GlcN產(chǎn)量高于對(duì)照菌株，這一方面可能由于nagE基因的敲除減少了GlcNAc向胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，另一方面可能是由于菌濃的不同造成的。通過(guò)計(jì)算單位菌體的GlcN得率發(fā)現(xiàn)，對(duì)照菌株在 12 h時(shí)，單位菌體的 GlcN產(chǎn)量為1.02 g/g DCW，高于此時(shí)E. coli-glms-gna1-?nagE的0.81 g/g DCW。對(duì)照菌株的GlcN生產(chǎn)強(qiáng)度在8 h時(shí)達(dá)到最高值0.35 g/(L·h)，而E. coli-glmsgna1-?nagE的GlcN生產(chǎn)強(qiáng)度在10 h時(shí)達(dá)到最高值0.38 g/(L·h)，隨后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，說(shuō)明GlcN的合成速度在前10 h內(nèi)最快。

在發(fā)酵過(guò)程中，E. coli-glms-gna1-?nagE和對(duì)照菌株發(fā)酵液中的GlcNAc產(chǎn)量均呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，但對(duì)照菌株在發(fā)酵后期GlcNAc水平下降較為明顯，而E. coli-glms-gna1-?nagE在后期發(fā)酵中GlcNAc水平基本保持在60 g/L以上。E. coli-glms-gna1-?nagE在培養(yǎng)至 12 h，GlcNAc產(chǎn)量達(dá)到最大值71.80 g/L，較對(duì)照菌株的GlcNAc產(chǎn)量最高值 (41.50 g/L) 提高了73%。從表3還可看出，對(duì)照菌株在殘?zhí)堑陀?0 g/L時(shí)，GlcNAc產(chǎn)量從最高值41.50 g/L下降到27.00 g/L，下降達(dá)35%，而E. coli-glms-gna1-?nagE在殘?zhí)堑陀?0 g/L時(shí)，GlcNAc產(chǎn)量從最高值71.80 g/L下降到63.60 g/L，僅下降了11%，這說(shuō)明nagE基因的敲除在發(fā)酵后期能減少GlcNAc向胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，使發(fā)酵液中GlcNAc產(chǎn)量維持穩(wěn)定。nagE基因的敲除對(duì)于提高氨糖的產(chǎn)量效果明顯，也說(shuō)明對(duì)照菌株的GlcNAc產(chǎn)量受殘?zhí)菨舛茸兓绊戯@著，而E. coli-glms-gna1- ?nagE的GlcNAc產(chǎn)量受殘?zhí)菨舛茸兓绊懖幻黠@。E. coli-glmsgna1-?nagE和對(duì)照菌株的GlcNAc生產(chǎn)強(qiáng)度分別在10 h和6 h時(shí)達(dá)到最大值，為6.17 g/(L·h) 和6.65 g/(L·h)，說(shuō)明對(duì)照菌株在殘?zhí)菨舛容^高時(shí)生產(chǎn)強(qiáng)度較高，而E. coli-glms-gna1-?nagE的生產(chǎn)強(qiáng)度受殘?zhí)菨舛扔绊懖淮?。E. coli-glmsgna1-?nagE單位菌體干重的 GlcNAc產(chǎn)量在10 h達(dá)到最高值15.00 g/g DCW，而對(duì)照菌株單位菌體干重的GlcNAc產(chǎn)量在6 h達(dá)到最高值16.80 g/g DCW，可見(jiàn)對(duì)照菌株和E. coli-glmsgna1-?nagE單位菌體干重的GlcNAc產(chǎn)量相差不明顯，E. coli-glms-gna1-?nagE在殘?zhí)菨舛葹?1.00 g/L時(shí)的單位菌體干重的GlcNAc產(chǎn)量和對(duì)照菌株在殘?zhí)菨舛葹?2.00 g/L時(shí)的單位菌體干重的GlcNAc產(chǎn)量相近 (分別為15.00 g/g DCW和16.80 g/g DCW)，說(shuō)明殘?zhí)菨舛鹊南陆祵?duì)E. coli-glms- gna1-?nagE單位菌體干重的GlcNAc產(chǎn)量影響不大。

2.3.2 E. coli-glms-gna1-?nagE-?manX 發(fā)酵結(jié)果

從圖7和表3可以看出，E. coli-glms-gna1-?nagE-?manX的菌濃在 18 h時(shí)達(dá)到最高值7.03 g/L，而對(duì)照菌株的菌濃在14 h時(shí)就達(dá)到最高值4.68 g/L，這可能與菌株2個(gè)基因被敲除，用于合成細(xì)胞膜的相關(guān)物質(zhì)的代謝受到影響有關(guān)。比較E. coli-glms-gna1-?nagE和E. coli-glmsgna1- ?nagE-?manX的菌濃發(fā)現(xiàn)，前者最高值略低于后者，但前者的比生長(zhǎng)速率卻高于后者，這可能是由于2個(gè)基因的敲除在更大程度上抑制了氨基葡萄糖向胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，細(xì)胞比生長(zhǎng)速率受到影響，但由于碳源葡萄糖的存在，其轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)并未受到影響，細(xì)胞依然能通過(guò)攝取葡萄糖合成自身生長(zhǎng)需要的物質(zhì)。

圖7 E. coli-glms-gna1-?nagE-?manX發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig. 7 Results of GlcN and GlcNAc production by E. coli-glms-gna1-?nagE-?manX.

表3 E. coli-glms-gna1-?nagE, E. coli-glms-gna1-?nagE-?manX和E. coli-glms-gna1氨基葡萄糖發(fā)酵參數(shù)比較Table 3 Comparison of parameters of the glucosamine fermentation by E. coli-glms-gna1-?nagE, E. coli-glms-gna1- ?nagE-?manX and E. coli-glms-gna1

在發(fā)酵過(guò)程中，E. coli-glms-gna1-?nagE-?manX在10 h時(shí)GlcN產(chǎn)量達(dá)到最大值4.82 g/L，隨后呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)，這可能是因?yàn)?nagE和manX基因的敲除未能完全抑制GlcN向胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)碳源的需求導(dǎo)致GlcN能依靠ptsG編碼的酶ⅡCBGlc進(jìn)入細(xì)胞，而對(duì)照菌株在培養(yǎng)至12 h時(shí)GlcN產(chǎn)量達(dá)到最高值4.06 g/L。這一方面是由于此時(shí)殘?zhí)菨舛任聪陆档接绊懠?xì)胞合成GlcN的水平，另一方面是因?yàn)榇藭r(shí)E. coli-glmsgna1-?nagE-?manX的菌濃高于對(duì)照菌株的菌濃，通過(guò)比較此時(shí)單位菌體 GlcN的產(chǎn)量可以發(fā)現(xiàn)E. coli-glms-gna1-?nagE-?manX單位菌體 GlcN的產(chǎn)量 1.10 g/g DCW 高于對(duì)照菌株單位菌體GlcN的產(chǎn)量1.02 g/g DCW。對(duì)照菌株的GlcN生產(chǎn)強(qiáng)度在 8 h時(shí)達(dá)到最高值 0.35 g/(L·h)，而E. coli-glms-gna1-?nagE-?manX的GlcN生產(chǎn)強(qiáng)度在6 h時(shí)達(dá)到0.59 g/(L·h)，隨后呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。就GlcN產(chǎn)量而言，E. coli-glms-gna1-?nagE產(chǎn)量的最高值較E. coli-glms-gna1-?nagE-?manX低 0.44 g/L，且兩者均高于對(duì)照菌株，這說(shuō)明敲除nagE基因能增加葡萄糖向GlcN的代謝，彌補(bǔ)因 GlcNAc不能向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。

在發(fā)酵過(guò)程中，E. coli-glms-gna1-?nagE-?manX和對(duì)照菌株發(fā)酵液中的GlcNAc產(chǎn)量均呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，但 E. coli-glms-gna1-?nagE-?manX在發(fā)酵后期的GlcNAc水平基本保持在90 g/L以上，在培養(yǎng)至10 h，GlcNAc產(chǎn)量達(dá)到最大值 118.70 g/L，較對(duì)照菌株的 GlcNAc產(chǎn)量最高值 (41.50 g/L) 提高了 186%，說(shuō)明manX基因的敲除效果明顯，使發(fā)酵液中GlcNAc產(chǎn)量維持穩(wěn)定。E. coli-glms-gna1-?nagE-?manX和對(duì)照菌株的GlcNAc生產(chǎn)強(qiáng)度均在培養(yǎng)至6 h時(shí)最大，分別為15.50 g/(L·h) 和6.65 g/(L·h)，隨后均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。E. coli-glms-gna1-?nagE-?manX單位菌體干重的GlcNAc產(chǎn)量在8 h達(dá)到最高值 28.70 g/g DCW，而 E. coli-glms-gna1-?nagE和對(duì)照菌株單位菌體干重的 GlcNAc產(chǎn)量分別在10 h和6 h達(dá)到最高值15.00 g/g DCW和16.80 g/g DCW，這說(shuō)明nagE和manX雙基因的敲除效果顯著。

3 討論

Red重組敲除技術(shù)是近年來(lái)興起的基于λ噬菌體 Red重組酶和體內(nèi)同源重組反應(yīng)的新型遺傳工程技術(shù)，該技術(shù)主要利用λ噬菌體的3個(gè)重組蛋白酶來(lái)完成體外DNA片段與染色體的同源重組。和其他基因敲除技術(shù)相比，該技術(shù)省去了體外DNA酶切與連接的步驟，使細(xì)菌染色體靶基因的敲除與替換操作相對(duì)簡(jiǎn)單，因而逐漸成為基因功能探索以及新工程菌株構(gòu)建的有效手段。通常對(duì)基因的敲除都會(huì)對(duì)菌體的生長(zhǎng)和代謝造成一定的影響，甚至引起菌體死亡。通過(guò)比較原菌株與基因敲除菌株的比生長(zhǎng)速率以及菌濃發(fā)現(xiàn)，基因敲除對(duì)菌體生長(zhǎng)未出現(xiàn)較大的影響，這可能一方面是與菌體細(xì)胞膜合成途徑相關(guān)聯(lián)的glmS及gna1基因得到了高效表達(dá)，因而對(duì)菌體生長(zhǎng)起到一定的促進(jìn)作用；另一方面，胞外的GlcN能通過(guò)ptsG編碼的酶ⅡCBGlc進(jìn)入細(xì)胞，在碳源不足時(shí)起到補(bǔ)償作用。由于GlcNAc對(duì)細(xì)胞的刺激遠(yuǎn)小于 GlcN，這是造成細(xì)胞內(nèi)不能積累GlcN的主要原因之一，所以nagE基因是本研究第一個(gè)被敲除的基因。通過(guò)對(duì)nagE和manX基因的敲除，能提高氨糖的生產(chǎn)強(qiáng)度，或者能縮短菌體達(dá)到最大生產(chǎn)強(qiáng)度的時(shí)間，這在工業(yè)生產(chǎn)上具有較大優(yōu)勢(shì)，能充分利用發(fā)酵液中的碳源，提高碳源轉(zhuǎn)化率，降低成本，也能簡(jiǎn)化下游提取工藝，降低污染。對(duì)大腸桿菌nagE和manX雙基因的敲除，使其 GlcNAc產(chǎn)量達(dá)到最大值118.70 g/L，遠(yuǎn)高于單基因敲除菌株和對(duì)照菌株；且雙基因的敲除菌株單位菌體干重的GlcNAc產(chǎn)量較對(duì)照菌株提高71% (16.80 g/g DCW)，較單基因敲除菌株提高91% (15.00 g/g DCW)，這說(shuō)明nagE和manX雙基因的敲除能顯著提高氨糖的產(chǎn)量，對(duì)于改造大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)氨糖具有重要的意義，為最終實(shí)現(xiàn)氨糖的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

REFERENCES

[1] Deng MD, Wassink SL, Grund AD. Engineering a new pathway for N-acetylglucosamine production: coupling a catabolic enzyme, glucosamine-6-phosphate deaminase, with a biosynthetic enzyme, glucosamine-6-phosphate N-acetyltransferase. Enzyme Microb Technol, 2006, 39(4): 828?834.

[2] Hsieh JW, Wu HS, Wei YH, et al. Determination and kinetics of producing glucosamine using fungi. Biotechnol Prog, 2007, 23(5): 1009?1016.

[3] Sitanggang AB, Wua HS, Wang SS, et al. Effect of pellet size and stimulating factor on the glucosamine production using Aspergillus sp. BCRC 31742. Bioresour Technol, 2010, 101(10): 3595?3601.

[4] Deng MD, Severson DK, Grund AD, et al. Metabolic engineering of Escherichia coli for industrial production of glucosamine and N-acetylglucosamine. Metab Eng, 2005, 7(3): 201?214.

[5] Sachadyn P, J?drzejczak R, Milewski S, et al. Purification to homogeneity of Candida albicans glucosamine-6-phosphate synthase overexpressed in Escherichia coli. Protein Expres Purif, 2000, 19(3): 343?349.

[6] Deng MD, Grund AD, Wassink SL, et al. Directed evolution and characterization of Escherichia coli glucosamine synthase. Biochimie, 2006, 88(5): 419?429.

[7] Teplyakov A, Leriche C, Obmolova G, et al. From lobry de bruyn to enzyme-catalyzed ammonia channelling: molecular studies of D-glucosamine-6P synthase. Nat Prod Rep, 2002, 19(1): 60?69.

[8] Sashiwa H, Fujishima S, Yamano N, et al. Production of N-acetyl-D-glucosamine from α-chitin by crude enzymes from Aeromonas hydrophila H-2330. Carbohydr Res, 2002, 337(8): 761?763.

[9] Kuk JH, Jung WJ, Jo GH, et al. Production of N-acetyl-β-D-glucosamine from chitin by Aeromonas sp. GJ-18 crude enzyme. Appl Microbiol Biotechnol, 2005, 68(3): 384?389.

[10] Donzelli BGG, Ostroff G, Harman GE. Enhanced enzymatic hydrolysis of langostino shell chitin with mixtures of enzymes from bacterial and fungal sources. Carbohydr Res, 2003, 338(18): 1823?1833.

[11] Kudan S, Eksittikul T, Pichyangkura R, et al. Preparation of N-acetyl-D-glucosamine and N, N’-diacetylchitobiose by enzymatic hydrolysis of chitin with crude chitinases. J Biotechnol, 2010, 150: 89.

[12] Matsumoto Y, Saucedo-Casta?eda G, Revah S, et al. Production of β-N-acetylhexosaminidase of Verticillium lecanii by solid state and submerged fermentations utilizing shrimp waste silage as substrate and inducer. Process Biochem, 2004, 39(6): 665?671.

[13] Chmielowski RA, Wu HS, Wang SS. Scale-up of upstream and downstream operations for the production of glucosamine using microbial fermentation. Biotechnol J, 2007, 2(8): 996?1006.

[14] Rattanakit N, Yano S, Wakayama M, et al. Saccharification of chitin using solid-state culture of Aspergillus sp. Sl-13 with shellfish waste as a substrate. J Biosci Bioeng, 2003, 95(4): 391?396.

[15] Durand P, Golinelli-Pimpaneau B, Mouilleron S, et al. Highlights of glucosamine-6P synthase catalysis. Arch Biochem Biophys, 2008, 474(2): 302?317.

[16] Joanna R, Olchowy J, Konariev PV, et al. The crystal and solution studies of glucosamine-6-phosphate synthase from Candida albicans. J Mol Biol, 2007, 372(3): 672?688.

[17] Beatriz RN, Angel R, Honorina MB, et al. Transport of N-acetyl-D-mannosamine and N-acetyl-D-glucosamine in Escherichia coli K1: effect on capsular polysialic acid production. FEBS Lett, 2002, 511(1/3): 97?101.

[18] Van Montfort RL, Pijning T, Kalk KH, et al. The structure of the Escherichia coli phosphotransferase IIAmannitolreveals a novel fold with two conformations of the active site. Structure, 1998, 6(3): 377?388.

[19] Datsenko KA, Wanner BL. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97(12): 6640?6645.

[20] Doublet B, Douard G, Targant H, et al. Antibiotic marker modifications of λ Red and FLP helper plasmids, pKD46 and pCP20, for inactivation of chromosomal genes using PCR products in multidrug-resistant strains. J Microbiol Methods, 2008, 75(2): 359?361.

[21] Su C, Xia WS, Yao HY. The determination of glucosamine and N-acetylglucosamine. Sci Tech Food Ind, 2003, 24(6): 74?75, 77.蘇暢, 夏文水, 姚惠源. 氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖的測(cè)定方法. 食品工業(yè)科技, 2003, 24(6): 74?75, 77.

[22] Wang YF, Yan LZ, Guo XQ. Determination of N-acetyl-D-glucosamine in D-glucosamine hydrochloride by HPLC with refractive index detector. J Cap Norm Univ: Nat Sci Ed, 2008, 29(1): 40?42.王英鋒, 晏利芝, 郭雪清. HPLC示差折光分析法測(cè)定D-氨基葡萄糖鹽酸鹽中的N-乙酰-D-氨基葡萄糖. 首都師范大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2008, 29(1): 40?42.