田靈芝，徐美娟，饒志明

江南大學工業(yè)生物技術教育部重點實驗室 江南大學應用微生物與代謝工程研究室，江蘇 無錫 214122

γ-氨基丁酸 (簡稱 GABA) 是一種在中樞神經系統(tǒng)中有效的抑制性神經遞質[1]，具有許多重要的生理功能，如降血壓、保持神經安定[2]、增強記憶、調節(jié)激素分泌、促進生殖、保肝利腎等[3]。近年來，GABA的研究和應用受到了廣泛的關注。目前，國內外主要采用化學合成法[4]和微生物法[5]制備GABA，化學合成法反應條件劇烈，污染嚴重[6]；微生物發(fā)酵法條件溫和、安全、成本較低，但后處理過程復雜且生產周期長[7-8]；而全細胞轉化法合成GABA可提高底物轉化率和產品純度，簡化后處理工序、縮短生產周期且降低環(huán)境污染，因此受到國內外研究者的廣泛重視[9]。

本實驗室前期通過菌種篩選獲得一株植物乳桿菌，此菌株具有較高的谷氨酸脫羧酶活力，原始菌株搖瓶水平轉化24 h，GABA的產量可達到34.66 g/L[10]，原始菌株經誘變處理后5 L發(fā)酵罐全細胞轉化24 h，GABA濃度達到65.45 g/L，摩爾轉化率為 97.56%，產量明顯高于其他同類菌株。但是，由于植物乳桿菌是兼性厭氧微生物，培養(yǎng)條件較難控制且培養(yǎng)條件的變化對 GABA的生產效率影響比較顯著；同時，GAD是生物催化 L-谷氨酸脫羧反應生成 γ-氨基丁酸的限速酶，反應方程式如下：

在植物乳桿菌野生菌株中各酶的表達量受到菌體自身代謝水平的調控[11]，因而其GAD的本底表達量不高導致了全細胞轉化效率受限。鑒于此，本研究擬通過構建GAD高表達型重組大腸桿菌，借助大腸桿菌生長迅速、易于高密度培養(yǎng)和 GAD表達可以人工調控的優(yōu)點進行GABA高效率生產。另外，通過對該酶的酶學性質進行研究，即酶的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性及溫度、pH與酶活性的關系，幾種金屬離子對酶活的影響，來確定該酶作用的合適條件指導全細胞轉化法合成 GABA，并為工業(yè)化制備GABA提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

大腸桿菌 Escherichia coli JMl09、BL21 (DE3) 由本實驗室保藏，植物乳桿菌Lactobacillus plantarum GB 01-21由本實驗室篩選并誘變獲得，克隆載體pMDl8-T購自TaKaRa公司，質粒pET-28a (+) 購自Novagen公司。

1.1.2 培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基

培養(yǎng)溫度37 ℃，旋轉式搖床轉速200 r/min，氨芐青霉素濃度為100 mg/L，卡那霉素濃度為50 mg/L篩選轉化子，IPTG 誘導終濃度為0.5~1 mmol/L。

重組菌搖瓶種子培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖1.0，蛋白胨3.0，玉米漿1.5，NaCl 0.3，K2HPO40.1，MgSO4·7H2O 0.05。在pH 6.5~7.0、121 ℃下滅菌10 min。

重組菌發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖5.0，蛋白胨 10，玉米漿 7.5，NaCl 0.5，K2HPO40.1， MgSO4·7H2O 0.05，L-谷氨酸1.0，生物素2×10?5。pH 6.5~7.0、121 ℃下滅菌10 min。

1.1.3 主要試劑和儀器

質粒小量抽提試劑盒、膠回收試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術有限公司。工具酶、IPTG購自TaKaRa公司。咪唑和抗生素購自上海Sangon公司。丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺(American Promega Corporation)、廣范圍蛋白質分子量標準購自Fermentas公司。PCR引物由上海賽百盛基因技術有限公司合成。其他試劑均為國產試劑純。5 L發(fā)酵罐購于上海保興生物設備工程有限公司，氨基酸自動分析儀為日立835-50型，2619#樹脂 (陽離子交換柱Φ 2.6 mm×150 mm)。

1.2 方法

1.2.1 谷氨酸脫羧酶基因的克隆

根據(jù) NCBI中植物乳桿菌 Lactobacillus plantarum subsp. plantarum ST-Ⅲ (GI：308044682)全基因組核酸序列3 254 376 bp中的lpgad基因序列設計谷氨酸脫羧酶編碼基因的引物，上游引物P1：5′-GACGGATCC ATGGACCAGAAGCTG TTAAC-3′；下游引物P2：5′-GGCGCGGCCGCCA GGTGTGTTTAAAGCTGTT-3′ (下劃線分別表示BamH Ⅰ和Not Ⅰ酶切位點)。提取Lactobacillus plantarum染色體為模板，利用已設計好的引物PCR擴增獲得目的基因片段，PCR擴增條件為：94 ℃ 5 min ；94 ℃ 50 s，57 ℃ 1 min 30 s， 72 ℃2 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。所得片段經膠回收后與克隆載體pMDl8-T連接，轉化E. coli JMl09，經過氨芐青霉素抗性平板篩選，挑取陽性轉化子。提取質粒酶切鑒定，將重組質粒命名為T-Lpgad，測序由上海Sangon公司完成。

1.2.2 重組質粒 pET-28a-lpgad的構建及 GAD在大腸桿菌BL21中的表達

將 T-lpgad用 BamH Ⅰ和 Not Ⅰ進行雙酶切，膠回收lpgad片段，將其與經相同雙酶切處理獲得的線性化載體pET-28a (+) 混合，加入T4 DNA連接酶，16 ℃過夜連接，再轉化大腸桿菌BL21 (DE3) 感受態(tài)細胞，卡那霉素抗性篩選陽性菌落，提取質粒，進行雙酶切驗證，將符合預期結果的陽性轉化子接種至含卡那霉素 (終濃度為50 mg/L) 的LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，次日按1%接種量轉接，37 ℃培養(yǎng)至OD600約0.6~0.8，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，16 ℃過夜誘導表達[12]。

1.2.3 SDS-PAGE

采用5%的濃縮膠及12%分離膠的不連續(xù)垂直平板電泳進行蛋白分離，考馬斯亮蘭R-250染色[13]。

1.2.4 谷氨酸脫羧酶的純化

將過夜誘導表達的菌液于10 000 r/min、4 ℃離心15 min，收集菌體，用PBS緩沖液 (pH 7.4)懸浮菌體，超聲波破碎細胞，然后經0.45 μm濾膜過濾后上柱，經Ni-NTA純化[13]，得到純化后的GAD。

1.2.5 谷氨酸脫羧酶活力的測定

采用比色法[14]，首先配制底物溶液Macllvaine緩沖體系 (0.2 mol/L，pH 4.8，含0.1 mmol/L PLP，0.4 mol/L底物L-谷氨酸鈉)，取200 μL底物溶液和100 μL酶液在30 ℃反應一定時間，置于冰浴中，加入200 μL 0.2 mol/L硼酸緩沖液 (pH 9.0) 終止反應；再加入1.0 mL 6%苯酚和400 μL次氯酸鈉溶液，充分振蕩后，沸水浴中反應10 min，迅速在冰浴中冷卻顯色20 min，然后測定630 nm處吸光值變化。酶反應體系中 GABA的量以標準曲線確定，相對活力以單位時間內A630的變化表示，一個酶活力單位 (U) 定義為在測定條件下每分鐘產生1 μmol GABA所需的酶量。

1.2.6 蛋白質含量測定

粗酶液蛋白質含量采用Bradford法[15]測定，以BSA為標準蛋白。

1.2.7 谷氨酸脫羧酶的酶學性質研究

最適pH及pH穩(wěn)定性：配制pH 3.6~6.0的醋酸-醋酸鈉反應緩沖液，30 ℃下將酶液分別與不同pH的反應液混合，測定GAD在不同pH反應體系中的酶活，考察pH對酶促反應的影響。再將一定量的酶液加入到以上不同pH的反應緩沖液中，30 ℃下分別保溫2 h，測定剩余酶活，考察GAD在不同pH條件下的穩(wěn)定性。

最適溫度及熱穩(wěn)定性：采用pH 4.8的反應緩沖液，分別在20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、37 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃下測定酶活，研究溫度對酶反應的影響。將酶液置于以上不同溫度下保溫2 h、4 h、6 h、8 h、10 h，測定剩余酶活，考察GAD在不同溫度下的穩(wěn)定性。

不同金屬離子及EDTA對酶活的影響：在反應液中分別加入終濃度為 1 mmol/L的 Ca2+、Mg2+、K+、Fe2+、Fe3+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Na+、Ag+、Al3+、Li2+以及EDTA，30 ℃下測定GAD酶活，以不加金屬離子的反應液作為對照，研究不同金屬離子對其酶促反應的影響。另外，對具有明顯激活作用的金屬離子，配制不同的濃度進行梯度實驗測定。

Km值及Vmax的測定：配制不同濃度的L-谷氨酸鈉底物溶液，分別與酶液在30 ℃下反應，采用雙倒數(shù)作圖法確定GAD的Km及Vmax值。

1.2.8 重組大腸桿菌轉化L-谷氨酸產GABA

將斜面保藏的菌種接種至 50 mL (裝液量為10 mL) LB培養(yǎng)基中，于旋轉式搖床中37 ℃、160 r/min培養(yǎng)12 h進行活化，再以5%的接種量接入500 mL搖瓶 (裝液量為100 mL) 種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌體，按上述條件培養(yǎng) 24 h得到種子液，按 10%的接種量將培養(yǎng)好的種子液接入5 L全自動發(fā)酵罐 (裝液量為3 L)，先于37 ℃、250 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6，再向其中添加乳糖至終濃度為1 g/L，同時在線控制pH 6.8流加葡萄糖，30 ℃誘導發(fā)酵14 h至OD600為13.6，發(fā)酵結束后將培養(yǎng)好的菌體全部離心收集，雙蒸水洗滌3次，用2 L乙酸-乙酸鈉緩沖液 (pH 5.0)懸浮菌體，添加底物L-谷氨酸進行全細胞轉化，5 L發(fā)酵罐轉化條件：30 ℃、 250 r/min、120 L/h，轉化24 h后，加入15%的三氯乙酸終止反應，取1 mL進行適當稀釋后，氨基酸自動分析儀測定轉化液中GABA的量。

2 結果與分析

2.1 谷氨酸脫羧酶基因的克隆及分析

提取植物乳桿菌全基因組 DNA，用設計的引物進行擴增，得到長度為1 410 bp、編碼469個氨基酸的基因片段 (圖1)，連接pMDl8-T載體測序。Blast分析結果表明，擴增獲得的基因核苷酸序列與 NCBI中公布的 lpgad基因序列(GenBank Accession No. ADO00011.1) 同源性高達 99.36%，其相差 9個堿基，4個氨基酸。L. plantarum GB 01-21基因 lpgad已提交至GenBank數(shù)據(jù)庫 (Accession No. JN248358)。

圖1 lpgad基因的PCR擴增Fig. 1 PCR amplification of lpgad gene. 1: DL2 000 marker; 2: PCR products.

2.2 重組大腸桿菌表達載體的構建

將T-lpgad用BamHⅠ和NotⅠ進行雙酶切，膠回收 lpgad片段，將其與經相同酶切線性化的pET-28a (+) 載體連接，酶切驗證，重組質粒經BamHⅠ和NotⅠ進行雙酶切，釋放5 369 bp和 1 410 bp大小的片段 (圖 2)，分別對應于pET-28a (+) 和lpgad的大小，結果表明重組質粒構建成功，將其命名為pET-28a (+) -lpgad。

圖2 質粒pET-28a (+) -lpgad的酶切驗證Fig. 2 Identification of pET-28a (+) -lpgad by enzyme digestion. M1: λDNA/Hind III marker; 1: pET-28a (+)-lpgad digested with BamH I; 2: pET-28a (+) -lpgad digested with BamH I and Not I; M2: DL2 000 marker.

2.3 lpgad基因在E. coli BL21 (DE3) 中表達與重組蛋白GAD的純化

將pET-28a (+) -lpgad轉入BL21 (DE3)，在卡那霉素抗性 LB平板上挑選陽性轉化子，即pET-28a (+) -lpgad/BL21 (DE3)，IPTG誘導后的菌液經超聲波破碎細胞，上清液SDS-PAGE分析，檢測到一條分子量約為53 kDa的特異性條帶，與報道的目標蛋白大小一致[16]，如圖3所示。上清液測得比酶活為8.53 U/mg，是植物乳桿菌破碎細胞后粗酶液酶活的4.24倍。本實驗選用的表達載體pET-28a (+) 中含有6·His-Tag編碼序列，采用Ni-NTA純化谷氨酸脫羧酶GAD。純化后的GAD經SDS-PAGE分析結果見圖3，可看出經過純化后得到相對單一的條帶，基本上可以認為已得到相對較純的GAD酶蛋白。純化后酶液的比酶活達到32.45 U/mg，是純化前粗酶液酶活的3.8倍，回收率達53.32%。結果見表1。

2.4 谷氨酸脫羧酶GAD的酶學性質研究

2.4.1 最適pH及pH穩(wěn)定性

GAD在pH 3.6~6.0范圍內反應時測定其酶活，由圖4可見，最適pH為4.8，與已報道的微生物來源的GAD反應最適pH在4~5之間[17-19]基本一致。pH穩(wěn)定性方面，將GAD在pH 3.6~6.0不同pH條件下處理2 h后測定酶活性，GAD在pH 3.6~5.0范圍內保溫2 h后均能保持80%以上的酶活力，pH值大于5.2，酶活降低較為明顯，說明該GAD在酸性環(huán)境下相對穩(wěn)定，具有較高的酸依賴性。

2.4.2 最適溫度及熱穩(wěn)定性

在20 ℃~70 ℃范圍內進行GAD酶促反應，測得的酶活結果見圖5，由圖可知該GAD在低溫度范圍內，隨著溫度的升高，酶活呈上升趨勢，37 ℃時酶活性達到最高，溫度再繼續(xù)升高，酶活則呈下降趨勢。熱穩(wěn)定性試驗結果如圖 5所示GAD在20 ℃~40 ℃較穩(wěn)定，水浴保溫10 h后相對酶活仍在85%以上，說明該酶在此溫度范圍內具有較高的穩(wěn)定性，隨著溫度的升高，酶穩(wěn)定性逐漸下降，到達60 ℃時水浴保溫2 h，GAD迅速失活，幾乎檢測不到酶活且酶液出現(xiàn)絮狀沉淀，酶可能完全變性失活。

圖3 表達和純化產物的SDS-PAGE分析Fig. 3 SDS-PAGE analysis of expressed and purified GAD. 1: supernatant of E. coli Bi21; 2: supernatant of E. coli B121 with recombinant plasmid pET-28a (+) -lpgad; M: protein marker (kDa); 3: purified GAD.

表l 重組蛋白GAD純化表Table l Purification of recombinant GAD

圖4 谷氨酸脫羧酶的最適pH范圍及其pH穩(wěn)定性Fig. 4 The optimal pH (A) and pH stability (B) of GAD.

圖5 谷氨酸脫羧酶的最適反應溫度及其熱穩(wěn)定性Fig. 5 The optimal temperature (A) and thermal stability (B) of GAD.

2.4.3 不同金屬離子及EDTA對酶活性的影響

金屬離子經常可以作為酶促反應的輔助因子，因此在酶促反應中經常添加某些金屬離子來促進酶促反應的進行。在GAD酶促反應中添加各

種金屬離子以及 EDTA，其中以不加離子時的反應液作為對照，設其酶活為100%，其對GAD酶活的影響結果見表2?？梢钥闯鯩n2+、Fe2+、Fe3+、Ag+、Cu2+均對植物乳桿菌GAD的活力有較大的抑制作用，Li+、K+、Na+等對活性影響不明顯，Ca2+、Mg2+對該酶有較強的激活作用。為了進一步研究Ca2+、Mg2+對該重組酶GAD的影響，考酶活達 131%，可以考慮全細胞轉化體系中添加Ca2+、Mg2+作為GAD酶促反應的輔助因子，以期提高反應體系中GAD酶活，增強其轉化L-谷氨酸產GABA能力。察了兩種不同濃度金屬離子對重組酶 GAD的影響，確定最佳激活濃度，如圖6所示：2.5 mmol/L Ca2+時激活作用最明顯，相對酶活達 154%，3.5 mmol/L Mg2+對重組酶GAD的激活作用最強，

表2 金屬離子及EDTA對GAD酶活性的影響Table 2 Effect of metal ion and EDTA on the activity of GAD

圖6 不同濃度Ca2+、Mg2+對GAD酶活的影響Fig. 6 Effect of different concentration Ca2+ (A) and Mg2+ (B) on the activity of GAD.

2.4.4 谷氨酸脫羧酶Km值和Vmax測定

根據(jù)不同底物濃度與酶促反應的關系，按照米氏方程，采用Lineweaver-Burk作圖法，求重組GAD的表觀米氏常數(shù)，如圖7，可以得到Km為9.21 mmol/L，Vmax為7.58 mmol/(L·min)。

2.5 全細胞轉化條件的確定

圖7 重組GAD的Lineweaver-Burk作圖Fig. 7 Lineweaver-Burk plot of recombinant GAD.

通過對重組谷氨酸脫羧酶GAD酶學性質的初步研究，確定了其最適作用溫度、最適pH以及不同金屬離子和EDTA對重組GAD酶活性的影響，根據(jù)酶學性質的研究結果，將轉化體系的溫度、pH分別調整至最適值，并向其中添加對重組酶GAD具有促進作用的金屬離子，以此確定最適轉化條件為：乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 4.8)、2.5 mmol/L Ca2+、3.5 mmol/L Mg2+，轉化溫度37 ℃。

在進行輸出以前，還要設置相關的求解控制參數(shù)，包括計算時間控制(設為100 ms)、輸出頻率、沙漏控制類型、沙漏系數(shù)以及缺省設置。由LS-DYNA EXPORTE模塊輸出K文件，打K文件設置內存空間,以及為提高計算速度而適當進行質量縮放[6]的修改。設置K文件中的參數(shù)需要具有一定的理論基礎，難度比較大，但是正確的設置會大大提高求解效率，縮短仿真時間，將復雜的仿真模型快速求解。

2.6 重組大腸桿菌轉化L-谷氨酸產GABA研究

將5 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)至14 h的菌體進行離心收集，雙蒸水洗滌3次后，2 L乙酸-乙酸鈉緩沖液懸浮，菌體濃度達6.2 g/L，添加底物L-谷氨酸，分別在原始和優(yōu)化后的條件下進行全細胞轉化，以50 g/L的投料量進行分批投料，前期由于酶活水平較高，反應速率較快，投料間隔為每3 h投料一次，隨著反應的進行，酶活有所下降，反應速度變慢，12 h后，投料時間間隔延長到6 h，在轉速250 r/min、通氣量120 L/h的條件下轉化24 h，反應結束后轉化液離心取上清，加入15%的三氯乙酸終止反應，取1 mL進行適當稀釋后，氨基酸自動分析儀測得優(yōu)化前后反應體系的轉化液中產物 GABA濃度分別為 143.5 g/L和204.5 g/L，轉化率分別為97.32%和97.92%，與最初轉化條件相比，相同轉化時間下，優(yōu)化后反應體系的轉化液中 GABA累計濃度提高了42.5%。條件優(yōu)化前后，全細胞轉化液氨基酸自動分析儀測定結果如圖8所示：

圖8 氨基酸自動分析儀測定條件優(yōu)化前后全細胞轉化液中L-Glu與GABA的含量圖譜Fig. 8 Map of GABA and L-Glu of whole cell transformation solutions analyzed by auto amino acid analyzer. (A) Original condition. (B) Optimized condition.

3 討論

本課題組前期研究結果表明：一方面，植物乳桿菌厭氧培養(yǎng)時 GABA產量高于有氧環(huán)境，因此生長速度較好氧微生物慢，影響了菌體的生長；另一方面，植物乳桿菌中的低拷貝lpgad基因使得GAD的表達量有限，粗酶液酶活僅有2.01 U/mg，限制了GABA的生產效率。而增大酶的表達量及提供其合適的作用條件是提高全細胞轉化效率的兩個重要策略，本文構建了一株重組大腸桿菌BL21/pET-28a (+) -lpgad，借助其生長迅速、可高密度培養(yǎng)及pET-28a表達質粒中T7強啟動子等優(yōu)點，在簡化培養(yǎng)條件、縮短培養(yǎng)時間的基礎上，大幅度提高了GAD的表達量，重組菌破細胞后粗酶液酶活為植物乳桿菌中GAD酶活的4.24倍。另外，利用6·His-Tag采用Ni-NTA柱親和層析法將重組菌中 GAD進行純化，并對其酶學性質進行初步研究，確定了全細胞轉化時所需的酶的最適反應條件：最適pH為4.8，最適溫度為37 ℃，Ca2+、Mg2+作為激活劑。在此條件下，添加底物L-谷氨酸，5 L發(fā)酵罐轉化24 h，GABA累計濃度高達204.5 g/L，摩爾轉化率為97.92%，在國內外處于領先地位[20]，與初始轉化條件相比，轉化液中GABA累計濃度提高了 42.5%，在實驗室條件下實現(xiàn)了微生物高效率生產GABA，為其工業(yè)化應用奠定了良好的基礎。

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