玉章鋒 秦海東 鮑磊 鄧會標 張錚

膿毒癥是感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，嚴重者可引起膿毒癥休克(septic shock)，甚至多器官功能障礙綜合征(MODS)。急性腎損傷(AKI)是入院患者特別是ICU老年患者的常見并發(fā)癥，其發(fā)生率大約占到全部入院患者的1%～7%，占到ICU患者的1%～25%［1-2］。老年高血壓患者介入術(shù)后AKI發(fā)生率明顯增高［3］。在ICU病房中AKI患者的病死率為50%～70%。膿毒癥是AKI發(fā)生發(fā)展的危險因素之一，在發(fā)生膿毒癥的患者中幾乎有一半以上發(fā)生AKI。另外，AKI可以增加膿毒癥休克患者的短期死亡率［4-5］。因此，腎臟功能在膿毒癥和膿毒癥休克患者疾病的發(fā)生發(fā)展和預后的過程中起著至關(guān)重要的作用。

截至目前，血肌酐(SCr)和尿量仍是診斷AKI唯一可靠的檢測指標，也是AKI分期的依據(jù)。但是，SCr診斷AKI的敏感性和特異性不強，且易受到多種因素的影響，因此需要尋找新的診斷AKI的早期生物標志物。本實驗通過建立膿毒癥休克誘發(fā)AKI的動物模型，觀察膿毒癥休克合并AKI對腎臟功能的影響并探討新型生物標志物在膿毒癥休克合并AKI診斷中的意義。

1 材料與方法

1.1 動物分組及模型制備雄性新西蘭大白兔70只，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，由南京醫(yī)科大學動物實驗中心提供，按隨機數(shù)字表法分為對照組和模型組，各組又分別選取0、3、6、9、12 h時間點取材，每組7只。參照全竹富等［6］改進的盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)聯(lián)合靜脈注入內(nèi)毒素制備膿毒癥休克合并AKI動物模型：予20%烏拉坦3 ml/kg麻醉后，在無菌操作下取中、下腹部正中切口，長約8 cm，找出盲腸后模型組在距盲腸末端5 cm處用4號線結(jié)扎，并在盲腸游離末端戳孔，直徑0.5 cm，同時結(jié)扎其供應(yīng)血管，完成后將盲腸放回腹腔原位，關(guān)腹。右股靜脈置管補液，左頸動脈插管測動脈壓(ABP)，留置導尿管，術(shù)后待血壓穩(wěn)定15 min后予大腸桿菌內(nèi)毒素(LPS，血清型O55B5，SIGMA公司)600 μg/kg靜脈推注(對照組給予等量生理鹽水)，時間約15 min。以平均動脈壓降至基礎(chǔ)血壓值的60%視為達到休克標準，休克造模成功后即以1 ml/(kg·min)林格氏液進行復蘇，以平均動脈壓恢復至75 mmHg為早期休克復蘇的標準。實驗過程符合動物倫理學標準。

1.2 檢測指標及方法

1.2.1 兔腎組織光鏡檢查：各組分別取皮質(zhì)、髓質(zhì)和皮髓質(zhì)交界處組織標本作常規(guī)HE染色，在100倍及400倍下觀察腎組織病理損傷程度。

1.2.2 兔腎組織透射電鏡檢查：各組分別取腎組織標本作電鏡檢查。

1.2.3 兔腎功能檢查：各組新西蘭大白兔分別于休克后0、3、6、12 h點股靜脈取血，分離血清，經(jīng)自動生化分析儀檢測SCr、血尿素氮(BUN)。

1.2.4 中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(NGAL)、腎損傷分子1(KIM-1)和白介素18(IL-18)的測定：采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)雙抗體夾心法，按試劑盒說明操作，酶標儀測定。

1.3 統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料以均數(shù)±標準差(ˉx±s)表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用scheffe檢驗。以P＜0.05為具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 光鏡造模組顯示在6、12 h均有皮、髓質(zhì)交界區(qū)的腎小管變性及局灶性壞死，間質(zhì)廣泛水腫，多種炎細胞浸潤，并可見遠端腎小管和集合管有以淡紅色均質(zhì)蛋白為主的管型及腎小管擴張;對照組則病理改變較輕，可見間質(zhì)少有水腫，有較少的炎細胞浸潤，偶可見空泡變性和嗜酸性變。

2.2 透射電鏡造模組6 h點可見腎小球毛細血管內(nèi)皮細胞有不同程度腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，空泡變性，核染色質(zhì)邊集，微絨毛粘連倒伏、脫落;12 h點可見內(nèi)皮細胞腫脹，胞質(zhì)增多，線粒體增生模糊，近曲小管上皮細胞線粒體增生模糊或減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，空泡變性;對照組6 h點見內(nèi)皮細胞不同程度腫脹，空泡化不明顯，系膜細胞肥大增生，足細胞胞質(zhì)增多，肥大增生，腎小管管腔內(nèi)出現(xiàn)多種形態(tài)的脫落物。

2.3 模型組與對照組間檢測指標的比較造模組各時間點生化檢測指標均高于對照組;隨時間延長，造模組各項生化檢測指標逐漸升高;與對照組比較，造模組12 h時間點SCr水平明顯升高(P＜0.05);BUN各時間點比較無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);與對照組比較3 h時間點NGAL即明顯升高(P＜0.05);KIM-1和IL-18于9 h時間點開始明顯升高(均P＜0.05)。見表1。

3 討論

膿毒癥休克也稱感染性休克，是由革蘭陰性或陽性細菌、立克次體、霉菌、病毒等病原微生物及其毒素等產(chǎn)物引起的人體有效循環(huán)血量急劇減少，組織血液灌注嚴重不足從而導致全身各重要器官和細胞的功能代謝障礙及結(jié)構(gòu)損害的一種急危重癥。腎臟是膿毒癥和膿毒癥休克最易受累的器官之一，AKI又是影響膿毒癥和膿毒癥休克患者疾病發(fā)生發(fā)展和預后的重要因素，然而目前對ICU老年患者進行膿毒癥AKI的流行病學研究的資料較少［7-8］。兩個多中心研究顯示，在ICU所有發(fā)生AKI的患者中有46%～48%是由膿毒癥和膿毒癥休克引起的［9-10］。

AKI最初被稱為ARF，它概括了從腎功能微小改變到最終腎功能衰竭整個過程，準確地反映了疾病的基本性質(zhì)，對早期診斷和治療具有積極的意義［11］。ARF是繼惡性腫瘤、肺部感染和心血管疾病之后引起老年糖尿病患者死亡的主要原因之一［12］。傳統(tǒng)的血清學指標SCr缺乏敏感性和特異性，不能準確地反映腎功能的變化，亦不能反映出腎損傷的性質(zhì)和部位。本研究通過對NGAL、KIM-1和IL-18的檢測以及與SCr、BUN對比發(fā)現(xiàn)，NGAL在AKI發(fā)生發(fā)展的過程中開始升高的時間要明顯早于SCr、KIM-1和IL-18開始升高的時間亦要早于SCr，另外NGAL的升高要早于病理損傷結(jié)果，SCr的明顯改變則遲于病理損傷的出現(xiàn)。

表1 2組間各時間點檢測指標的比較(±s，n=7)

表1 2組間各時間點檢測指標的比較(±s，n=7)

注：與對照組比較，*P＜0.05;與同組術(shù)后0 h比較，▲P＜0.05

組別時間Scr(μmol/L)BUN(mmol/L)NGAL(μg/L)KIM-1(μg/L)IL-18(ng/ml)模型組術(shù)后0 h28.76±4.513.40±0.7527.05±5.415.35±1.5 4056.11±5.26 342.55±7.73術(shù)后3 h34.68±5.714.19±1.3189.17±7.18＊▲5.84±1.2443.84±5.32術(shù)后6 h50.20±12.553.96±1.14115.54±8.20＊▲6.12±1.4346.96±4.43術(shù)后9 h56.70±19.016.13±3.36283.81±15.05＊▲31.98±8.42＊▲102.52±9.58＊▲術(shù)后12 h165.20±20.42＊▲6.17±3.99311.57±7.57＊▲55.02±8.23＊▲210.23±20.33＊▲對照組術(shù)后0 h27.92±1.243.48±0.3629.91±1.705.47±0.8243.54±3.67術(shù)后3 h28.79±0.984.01±0.6529.93±3.695.87±0.8744.70±4.14術(shù)后6 h29.43±1.253.59±0.4132.27±3.986.93±0.2447.50±5.96術(shù)后9 h30.47±1.213.97±0.7234.97±2.327.28±0.6355.77±8.34術(shù)后12 h32.13±2.693.74±0.3634.63±4.787.90±1.

NGAL是一種具有鐵離子螯合轉(zhuǎn)運功能的脂質(zhì)蛋白，其體內(nèi)表達水平可以反映腎小球濾過屏障、近端腎小管的重吸收功能和遠側(cè)腎單位的損傷情況。Mishra等［13］的研究發(fā)現(xiàn)NGAL在順鉑誘導的AKI 3 h后即可檢測到，而96 h后SCr才檢測到明顯升高。心臟介入術(shù)后發(fā)生AKI的患者在手術(shù)后1～2 h血、尿NGAL濃度明顯升高，比SCr明顯升高要早48～72 h，血液中NGAL檢測特異性為74%，敏感性達90%，尿液中NGAL檢測特異性為80%，敏感性76%，可見其與AKI的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［14-15］。本實驗中，NGAL水平在休克術(shù)后3 h開始明顯升高，這與上述研究結(jié)果相一致，但同時應(yīng)該指出，NGAL是通過腎小球濾過的，其在炎性及感染條件下也會升高，因而將血漿及尿液NGAL水平用于診斷膿毒癥AKI及膿毒癥休克引起的AKI還需要進一步研究。IL-18是一種促炎癥細胞因子，一般在近端小管產(chǎn)生和釋放。有實驗證明，在缺血性腎損傷中，在Scr尚未明顯升高前就能在近端小管大量檢測到IL-18，其特異性和敏感性均超過90%，因此，尿IL-18水平對AKI的診斷是一個很有價值的工具。本研究結(jié)果顯示，IL-18在術(shù)后9 h即明顯升高，此結(jié)果比SCr和BUN提前約3 h，而此時腎臟的病理損傷尚未明顯出現(xiàn)，如此時給予干預措施將明顯改善患者的預后。KIM-1是一種由334個氨基酸殘基組成的跨膜蛋白，在正常腎組織中幾乎不表達，但是在缺血及腎毒性損傷的腎小管上皮細胞中卻呈高表達狀態(tài)。Han等［16］發(fā)現(xiàn)，在40例兒童行心臟手術(shù)的病例對照研究中20例患者發(fā)生了AKI，20例沒有發(fā)生，其尿液KIM-1水平明顯不同，其12 h點預測AKI的AUC為0.83，此時其他腎功能檢測指標(肌酐清除率、BUN等)均無明顯改變。本實驗中，KIM-1亦于9 h點開始明顯升高，與IL-18臨床意義相似，但其相對局限于缺血及腎毒性損傷疾病中，故有臨床鑒別意義。

綜上所述，良好的生物學標志物應(yīng)該是能夠客觀地被測量或評價的指標，并且可以用于疾病病理過程［17］。本研究結(jié)果顯示NGAL、IL-18和KIM-1可用于檢測AKI的早期診斷和預測，其敏感性和特異性均優(yōu)于傳統(tǒng)的SCr等生物學指標，但其還僅限于實驗室和動物實驗中，進一步的臨床推廣和商業(yè)開發(fā)還有待于大規(guī)模臨床驗證和多中心的隊列研究。

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