劉俊，趙金良，張敏，代威

(上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室，上海 201306）

鱖胰島素樣生長因子－ⅡcDNA基因的克隆與表達特征

劉俊，趙金良，張敏，代威

(上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室，上海 201306）

為全面獲得鱖Siniperca chuatsi GH－IGFs生長發(fā)育軸的調(diào)控因子特征，采用RT－PCR、cDNA末端快速擴增 (RACE）技術(shù)成功克隆了肝組織胰島素樣生長因子－Ⅱ (IGF－Ⅱ）cDNA序列。結(jié)果表明:鱖IGF－Ⅱ cDNA全長為1 643 bp，包括5'端非翻譯區(qū)103 bp、3'端非翻譯區(qū)892 bp和開放閱讀框648 bp，開放閱讀框編碼215個氨基酸;鱖IGF－Ⅱ前肽由信號肽、成熟肽和E肽3部分組成，其中信號肽為47個氨基酸，成熟肽為70個氨基酸，E肽為98個氨基酸;鱖IGF－Ⅱ氨基酸序列與其他脊椎動物的相似度為81%～98%，與鱖IGF－Ⅰ的相似度為62.5%。運用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測了鱖成魚不同組織以及孵化后0～22 d仔稚魚中IGF－ⅡmRNA的表達情況，結(jié)果表明:IGF－ⅡmRNA在鱖腦中表達量最高，在肌肉、心臟、胃、鰓、腎臟中表達量次之，在脾、前腸、后腸、性腺、肝臟中表達量較低;在孵化后早期發(fā)育階段均檢測到有IGF－ⅡmRNA表達，孵化當(dāng)天 (0 d）表達量最高，之后表達量有所降低。本研究結(jié)果可為鱖IGF－Ⅱ?qū)ιL發(fā)育的調(diào)控作用研究提供科學(xué)依據(jù)。

鱖;胰島素樣生長因子－Ⅱ;基因表達

魚類具有特殊的生長模式，即成年期后仍繼續(xù)生長［1］。由于GH－IGFs軸是脊椎動物生長發(fā)育的主要內(nèi)分泌調(diào)控軸［2－3］，因此，魚類成為脊椎動物GH－IGFs軸生長調(diào)控作用研究的重要模式動物。胰島素樣生長因子 (Insulin－like growth factors，IGFs）是一類在結(jié)構(gòu)上與胰島素原具有高度同源性的多肽，IGF系統(tǒng)包括2個配體(IGF－Ⅰ、IGF－Ⅱ），2個受體 (IGF－Ⅰreceptor、IGF－Ⅱreceptor），6個結(jié)合蛋白 (IGF binding proteins，IGFBPs）［4］。其中，IGF－Ⅱ與胰島素、IGF－Ⅰ有67～70個同源氨基酸，通過IGF系統(tǒng)介導(dǎo)的信號通路，參與調(diào)節(jié)動物生長、繁殖、細(xì)胞增殖與分化、抑制細(xì)胞凋亡等多種生理作用［5］。

鱖Siniperca chuatsi是中國特有的名貴淡水經(jīng)濟魚類之一，也是鱖類中生長速度最快的種類。對其GH［6］和 IGF － Ⅰ［7］基因特征的研究已有報道。為全面掌握鱖IGF的基因特征，本研究中，作者通過RACE技術(shù)克隆了鱖IGF－ⅡcDNA全長序列，對其結(jié)構(gòu)特征進行了初步分析，并采用實時熒光定量PCR技術(shù)對成體不同組織以及個體發(fā)育早期階段IGF－ⅡmRNA的表達特征進行了分析，旨在為進一步開展鱖IGF－Ⅱ?qū)ιL發(fā)育的調(diào)控作用研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

鱖成魚、仔稚魚樣品均取自上海市浦東新區(qū)孫農(nóng)水產(chǎn)養(yǎng)殖場，仔稚魚分別于孵化后0、2、4、6、8、10、12、14、16、19、22 d采集，由于早期魚苗太小，孵化后0～12 d的樣品20尾為一組，孵化后13～22 d的樣品10尾為一組，每次采樣3組。魚苗先用無菌水沖洗，再用無菌吸水紙擦干，裝入無 RNase的 Eppendorf管中液氮速凍，并于－80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

總RNA抽提試劑RNAisoTMPlus、RNA PCR Kit(AMV）Ver.3.0、SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit、DNA Fragment Purification Kit、SYBRRPrimeScriptTMRT－PCR Kit、pMD19－T載體均購自寶生物工程 (大連）有限公司;DNA Ladder、Loading Buffer、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、大腸桿菌DH5α均購自天根生化科技 (北京）有限公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取與cDNA的合成 將鱖成魚活體解剖，取其肝組織，于液氮中冷凍并研磨，按照RNAisoTMPlus試劑盒說明書抽提總RNA。按照DNaseⅠ (RNase Free）試劑盒說明書去除基因組DNA的污染。使用SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒合成3'RACE－Ready－cDNA和5'RACE－Ready－cDNA，于冰箱 (－20℃）中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計與合成 所用引物見表1，均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 引物序列及退火溫度Tab.1 Nucleotide sequences and annealing temperature of oligonucleotide primers

1.2.3 RT－PCR和RACE擴增 IGF－ⅡcDNA小片段的RT－PCR擴增按照TaKaRa RNA PCR Kit(AMV）Ver.3.0說明書進行操作。RACE擴增按照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒說明書進行操作。主要步驟如下:以3'－RACEReady cDNA為模板，用通用引物UPM和GSPF1進行3'－RACE擴增，擴增程序為94℃下變性30 s，68℃下退火30 s，72℃下延伸3 min，共進行30個循環(huán)，于4℃下保存;以5'－RACE－Ready cDNA為模板，用通用引物UPM和GSPR1進行5'－RACE擴增，擴增程序為94℃下變性30 s，66℃下退火30 s，72℃下延伸2 min，共進行35個循環(huán)，于4℃下保存。同時，以IGF2F1和IGF2R1為引物，擴增含閱讀框的cDNA序列用于驗證。

1.2.4 產(chǎn)物純化、克隆與測序 RT－PCR和RACE產(chǎn)物經(jīng)12 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行回收純化。純化產(chǎn)物分別與pMD19－T載體連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)LB平板(含Amp+、IPTG和X－gal）培養(yǎng)后，篩選重組子進行插入片段檢測。序列測定由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 應(yīng)用BioEdit和Edit Seq軟件進行開放閱讀框 (ORF）分析并推導(dǎo)相應(yīng)的氨基酸序列;用Signal P 3.0 server軟件進行信號肽分析，用Scratch預(yù)測二硫鍵;用Blast軟件進行序列同源性分析，用Clustal W進行多序列比對，用EmbossMBOSS進行序列相似度分析;用Mega 4.1軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)進化樹。

1.2.6 實時熒光定量PCR分析 以腦組織總RNA(質(zhì)量濃度為500 ng/μL）為模板，按照 SYBRRPrimeScriptTMRT－PCR Kit試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用EASY Dilution進行10倍梯度稀釋，共設(shè)5個梯度，每個梯度設(shè)3個重復(fù)，分別以IGF－Ⅱ基因引物 (IGF2F2、IGF2R2）和內(nèi)參基因β－actin引物 (P1、P2）配制實時定量PCR反應(yīng)液，在BioRad IQ5實時熒光定量PCR儀上進行Real Time PCR反應(yīng)。根據(jù)各擴增曲線的Ct值及對應(yīng)各稀釋梯度的對數(shù)值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

分別提取3尾鱖成魚的胃、腎臟、脾、腦、前腸、后腸、鰓、心臟、性腺、肌肉、肝臟11個組織，以及孵化后 0、2、4、6、8、10、12、14、16、19、22 d仔稚魚總RNA，將起始濃度調(diào)到合適濃度后進行反轉(zhuǎn)錄，再以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，按照上述步驟分別進行IGF－Ⅱ和β－actin基因的Real Time PCR反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 鱖IGF－ⅡcDNA全長序列與結(jié)構(gòu)特征

小片段擴增產(chǎn)物經(jīng)克隆、測序后獲得長266 bp片段，再用 Blastn檢索 NCBI核酸數(shù)據(jù)庫，用Blastx檢索NCBI蛋白質(zhì)庫，發(fā)現(xiàn)該序列與其他魚類IGF－Ⅱ有較高的同源性，初步確定此片段為鱖IGF－ⅡcDNA部分序列;3'RACE產(chǎn)物經(jīng)測序得到長度為1 425 bp的序列(圖1－A），5'RACE產(chǎn)物經(jīng)測序得到長度為320 bp的序列(圖1－B）。將3'RACE、5'RACE和小片段序列進行比對、拼接后得到長度為1 643 bp cDNA全長序列 (GenBank序列號為HM164111.1）。以IGF2F1和IGF2R1為引物擴增包含編碼區(qū)的cDNA序列，進行驗證(圖1－C）。

注:A為3'RACE產(chǎn)物電泳圖，B為5'RACE產(chǎn)物電泳圖，C為編碼區(qū)產(chǎn)物電泳圖;M1為1 000 bp分子質(zhì)量標(biāo)記，M2為100 bp分子質(zhì)量標(biāo)記;1～3分別為3'RACE擴增產(chǎn)物、5'RACE擴增產(chǎn)物和編碼區(qū)擴增產(chǎn)物。Note:A，Electrophoretogram of 3'RACE product;B，Electrophoretogram of 5'RACE product;C，Electrophoretogram of coding region product;M1，1 000 bp molecular marker;M2，100 bp molecular marker;1 －3，Shows 3'RACE product，5'RACE product，and coding region product.

IGF－ⅡcDNA包括103 bp的5'端非翻譯區(qū)、648 bp的開放閱讀框 (ORF）、892 bp的3'端非翻譯區(qū)以及一個非典型的多聚腺苷酸 (attaaa）信號序列，開放閱讀框編碼215個氨基酸殘基 (圖2），相對分子質(zhì)量為24 700，等電點為9.96。其中，前47個氨基酸為信號肽，中間70個氨基酸為成熟肽，后98個氨基酸序列為E肽。氨基酸序列中，第56、68、96、97、101、110位的6個半胱氨酸可形成3個二硫鍵。

IGF－Ⅱ成熟肽由B、C、A、D 4個區(qū)域組成，其中B區(qū)域有32個氨基酸，C區(qū)域有11個氨基酸，A區(qū)域有21個氨基酸，D區(qū)域有6個氨基酸(圖3）。鱖IGF－Ⅱ成熟肽氨基酸序列與其他脊椎動物的相似度達到81%～98%，其中，B、A和D區(qū)域較為保守，C區(qū)域變異較大。

根據(jù)IGF－Ⅱ氨基酸序列構(gòu)建了脊椎動物NJ系統(tǒng)進化樹 (圖4），鱖和其他硬骨魚類聚為一支，哺乳類、鳥類和兩棲類聚為另一支，物種間的親緣關(guān)系與其傳統(tǒng)分類地位一致。

2.2 鱖各組織、幼體發(fā)育早期IGF－Ⅱ的表達

2.2.1 成體不同組織中IGF－ⅡmRNA的表達

利用實時熒光定量PCR法分析IGF－Ⅱ基因在不同組織中的表達情況，以內(nèi)參基因β－actin對各組織起始RNA進行校正，以腎組織作為對照因子，因目的基因IGF－Ⅱ和內(nèi)參基因β－actin擴增效率兼容［8］，故采用2－△△Ct法對不同組織 IGF － ⅡmRNA的表達量進行比較。從圖5可見:各組織中均有IGF－ⅡmRNA表達，其中IGF－ⅡmRNA在腦中表達量較高，在腎、胃、鰓、心臟、肌肉中表達量次之，在脾、前腸、后腸、性腺、肝臟中表達量較低。

2.2.2 幼體發(fā)育早期階段IGF－ⅡmRNA的表達

以內(nèi)參基因β－actin對各發(fā)育期起始RNA量進行校正，以孵化當(dāng)天 (0 d）作為對照因子，比較孵化后 2、4、6、8、10、12、14、16、19、22 d幼魚IGF－ⅡmRNA的表達水平。從圖6可見:各發(fā)育時期均有IGF－ⅡmRNA表達，但表達量有微小差異，孵化當(dāng)天表達量最高，之后表達量有所降低。

3 討論

本研究中運用RACE技術(shù)首次克隆獲得了鱖IGF－ⅡcDNA全長序列，推導(dǎo)的IGF－Ⅱ前體蛋白編碼為215個氨基酸，前肽由信號肽、成熟肽和E肽3部分組成，成熟肽由B、C、A、D 4個區(qū)域組成［9］。成熟肽中含有6個半胱氨酸殘基，2個位于B區(qū)域，4個位于A區(qū)域，可形成3個鏈內(nèi)二硫鍵，對維持IGF－Ⅱ的空間結(jié)構(gòu)有重要作用。

與鱖IGF －Ⅰ成熟肽相比［7］，鱖IGF－ Ⅱ的B和A區(qū)較為保守，D區(qū)保守性最高。鱖IGF－Ⅱ的B和A區(qū)中也含有與IGFBPs和IGFR作用所必需的一些保守氨基酸殘基，如A區(qū)Phe51、Ser53和B區(qū)Glu6、Thr7、Glu12、Gln18、Phe19參與 IGFBP 結(jié)合，A區(qū)Tyr62和B區(qū)Arg24、Phe26－Tyr27－Phe28參與IGFR結(jié)合［9］。

圖2 鱖IGF－ⅡcDNA全長和氨基酸序列Fig.2 The full length cDNA and deduced amino acid sequence in S.chuatsi IGF－Ⅱ

不同魚類IGF－Ⅱ基因的組織表達存在一定的差異。研究表明，鯉Cyprinus carpioIGF－ⅡmRNA在肝胰臟、心臟等組織中表達量較高，與IGF－Ⅰ的組織表達量相似 (鰓、精巢除外）［10］;半滑舌鰨Solea senegalensisIGF－Ⅱ與IGF－ⅠmRNA均在肝臟、鰓中表達水平較高［11］;金頭鯛SparusaurataIGF－Ⅱ mRNA在肝臟、心臟、鰓中表達水平較高［12］;而三長棘赤鯛Pagrus aurigaIGF－Ⅱ mRNA在鰓、心臟中表達水平較高，在肝臟中表達水平相對較低，IGF－Ⅰ主要在肝臟中表達［13］。本研究表明，鱖IGF－ⅡmRNA在所檢測成體的不同組織中均有表達，在腦中表達量最高，在肌肉和心臟中表達量較高，在肝臟中表達量較低，而IGF－Ⅰ在鱖成魚肝臟中表達量最高［7］，這一結(jié)果與三長棘赤鯛IGF－Ⅱ的組織表達特征［13］較為相似，表明IGF－Ⅱ與IGF－Ⅰ在不同器官組織中的生理功能存在一定差異。在鱖腦中IGF－ⅡmRNA表達量最高，可能與IGF－Ⅱ是腦中擔(dān)負(fù)重要調(diào)節(jié)作用的主效應(yīng)因子有關(guān)。研究表明，用不同劑量的豬生長激素處理，能顯著提高鯉肝臟和腦中IGF mRNA的表達水平，且具有劑量依賴效應(yīng)，肝臟中IGF－Ⅰ誘導(dǎo)表達量高于IGF－Ⅱ，而腦中IGF－Ⅱ表達水平對生長激素反應(yīng)更為靈敏［10，14］。

圖3 脊椎動物IGF－Ⅱ氨基酸序列比對Fig.3 Comparison of amino acid sequences of IGF－Ⅱamong vertebrates

圖4 脊椎動物IGF－Ⅱ的NJ系統(tǒng)進化樹Fig.4 The NJ phylogenetic tree of IGF－Ⅱamong vertebrates

圖5 鱖各組織IGF－ⅡmRNA的相對表達量Fig.5 Relative expression levels of IGF－ⅡmRNA in tissues of S.chuatsi

圖6 鱖幼體發(fā)育早期IGF－ⅡmRNA的相對表達量Fig.6 Relative expression of IGF－ⅡmRNA during larval development in S.chuatsi

魚類IGF－Ⅱ基因的發(fā)育表達特征與哺乳動物間存在明顯差異。哺乳動物胚胎發(fā)育早期IGF－Ⅱ基因表達量較高，之后表達量逐漸降低［2］，而魚類IGF－Ⅱ基因從胚胎發(fā)育早期到成體階段都有較高水平的表達。虹鱒Onchorynchus mykiss胚胎期(卵裂、原腸、器官形成）以及孵化后、卵黃吸收、開口攝食期間均觀察到IGF－Ⅰ和IGF－ⅡmRNA的表達［15］。金頭鯛 IGF－Ⅰ、IGF－Ⅱ mRNA的表達貫穿未受精卵、胚胎和仔魚整個發(fā)育期，IGF－ⅡmRNA在孵化后1 d的表達水平最高，隨后表達水平下降;IGF－ⅠmRNA在孵化后1 d開始表達，孵化后12～16 d表達水平顯著上升［16］。進一步研究表明，虹鱒IGF－Ⅱ基因還參與胚胎發(fā)育中溫度對生長作用的調(diào)節(jié)［17－18］，半滑舌鰨胚胎的生長速率與IGF－Ⅱ基因的表達水平呈正相關(guān)性［11］。本研究結(jié)果表明，鱖IGF－ⅡmRNA在孵化后0、2、4、6、8、10、12、14、16、19、22 d各期均有較高表達，孵化當(dāng)天 (0 d）表達量最高，孵化后第10 d表達量最低，之后表達水平又有緩慢上升，這表明IGF－Ⅱ是鱖早期生長發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子。前期研究表明，鱖仔魚在孵化后5 d開口攝食，12 d胃腺發(fā)育成熟［19］。因此，孵化后5～12 d是鱖消化系統(tǒng)發(fā)育成熟及營養(yǎng)方式由內(nèi)源性營養(yǎng)向外源性營養(yǎng)轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵期。鱖早期發(fā)育階段IGF－ⅡmRNA的表達特征變化，可能還與其參與仔魚的消化系統(tǒng)發(fā)育和營養(yǎng)方式轉(zhuǎn)變等調(diào)節(jié)活動有關(guān)。在半滑舌鰨胚胎孵化前和仔魚變態(tài)前觀察到IGF－ⅡmRNA表達水平較高，而在眼移位變態(tài)前表達水平顯著下降，推測IGF－Ⅱ 還參與變態(tài)發(fā)育調(diào)節(jié)［11］。

［1］ Thomas P M.Paradigms of growth in fish ［J］.Comp Biochem Physiol Part B，2001，129(2 －3）:207 －219.

［2］ 顧志良，王慧娟，郁建鋒.動物GH/IGF－Ⅰ軸調(diào)控機制的研究進展［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2011，38(10）:50 －54.

［3］ Moriyama S，Ayson F G，Kawauchi H.Growth regulation by insulin－ like growth factor－ I in fish［J］.Biosci，Biotech and Biochem，2000，64(8）:1553 －1562.

［4］ Duan C，Ding J，Schlueter P J，et al.A zebrafish view of the insulin－ like growth factor(IGF）signaling pathway［J］.Acta Zoolo Sin，2003，49(4）:421 －431.

［5］ Duan C.The insulin － like growth factor system and its biological actions in fish［J］.Am Zool，1997，37(6）:491 －503.

［6］ 魯雙慶，劉峰，劉臻，等.三種鱖魚生長激素基因的克隆及序列比較［J］.海洋與湖沼，2008，39(4）:354 －361.

［7］ 劉俊，趙金良，張敏，等.鱖胰島素樣生長因子－ⅠcDNA全長克隆及組織表達分析［J］.動物學(xué)雜志，2011，46(2）:121－129.

［8］ Johnson M R，Wang K，Smith J B，et al.Quantitation of dihydropyrimidine dehydrogenase expression by real－time reverse transcription polymerase chain reaction［J］.Anal Biochem，2000，278(2）:175 －184.

［9］ Duval H，Rousseau K，Elies G，et al.Cloning，characterization，and comparative activity of turbot IGF－Ⅰ and IGF－Ⅱ［J］.Gen Comp Endocr，2002，126(3）:269 －278.

［10］ Tse M C，Vong Q P，Cheng C H，et al.PCR － cloning and gene expression studies in common carp(Cyprinus carpio）insulin－like growth factor－ II［J］.Biochim Biophys Acta，2002，1575(1 － 3）:63－74.

［11］ Funes V，Asensio E，Ponce M，et al.Insulin － like growth factors I and II in the sole Solea senegalensis:cDNA cloning and quantitation of gene expression in tissues and during larval development［J］.Gen Comp Endocri，2006，149(2）:72 －166.

［12］ Duguay S J，Lai－ Zhang J，Steiner D F，et al.Developmental and tissue－regulated expression of IGF－Ⅰand IGF－ⅡmRNAs in Sparus aurata［J］.J Mol Endocrin，1996，16(2）:123 － 132.

［13］ Ponce M，Infante C，F(xiàn)unes V，et al.Molecular characterization and gene expression analysis of insulin－like growth factors I and II in the red banded seabream，Pagrus auriga:transcriptional regulation by growth hormone［J］.Comp Biochem Physiol Part B，2008，150(4）:418－426.

［14］ Vong Q P，Chan K M，Cheng C H.Quantification of common carp(Cyprinus carpio）IGF－Ⅰand IGF－ⅡmRNA by real－time PCR:differential regulation of expression by GH［J］.J Endocrinol，2003，178(3）:513 －521.

［15］ Greene M W，Chen T T.Temporal expression pattern of insulin －like growth factor mRNA during embryonic development in a teleost，rainbow trout(Oncorhynchus mykiss）［J］.Mol Mar Biol Biotech，1997，6(2）:144 －151.

［16］ Perrot V，Moiseeva E B，Gozes Y，et al.Ontogeny of the insulin －like growth factor system(IGF－Ⅰ，IGF－Ⅱ，and IGF－1R）in gilthead seabream(Sparus aurata）:expression and cellular localization［J］.Gen Comp Endocrin，1999，116(3）:445 －460.

［17］ Gabillard J C，Weil C，Rescan P Y，et al.Effects of environmental temperature on IGF－Ⅰ，IGF－Ⅱand IGF type I receptor expression in rainbow trout(Oncorhynchus mykiss）［J］.Gen Comp Endocrin，2003，133(2）:233 －242.

［18］ Gabillard J C，Rescan P Y，F(xiàn)auconneau B，et al.Effect of temperature on gene expression of the GH/IGF system during embryonic development in rainbow trout(Oncorhynchus mykiss）［J］.J Exp Zool Part A，2003，298(2）:134 －142.

［19］ 吳雪峰，趙金良，錢葉洲，等.鱖消化系統(tǒng)器官發(fā)生的組織學(xué)［J］.動物學(xué)研究，2007，28(5）:511 －518.

Cloning and expression of full－length cDNA of insulin－like growth factor－Ⅱin mandarin fish Siniperca chuatsi

LIU Jun，ZHAO Jin-liang，ZHANG Min，DAI Wei
(Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources，Ministry of Agriculture，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

The complete cDNA sequence of insulin－like growth factor－Ⅱ(IGF－Ⅱ）was cloned from liver of mandarin fishSiniperca chuatsiby RT－PCR and rapid amplification of cDNA ends(RACE）to evaluate the regulating characteristics of HG－ IGF－Ⅱaxis.A total of 1 643 bp IGF－ⅡcDNA sequence was found to be comprised of a 103 bp 5'－untranslated region，892 bp 3'－untranslated region and 648 bp open reading frame(ORF）encoding 215 amino acids with a signal peptides of 47 amino acids，a mature peptides of 70 amino acids and a E peptides of 98 amino acids.The mandarin fish IGF－Ⅱamino acid sequence showed similarity of 81% －98%with other vertebrate IGF－Ⅱs，but only similarity of 62.5%with the mandarin fish IGF－Ⅰ.The IGF－Ⅱ mRNA expression was detected in different adult tissues and larval development stages(0，2，4，6，8，10，12，14，16，19，and 22 days posthatching）using real－time quantitative PCR technique.The maximal expression was observed in the brain，followed by the in muscle，heart，stomach，gill，and kidney，and the lower expression in the spleen，foregut，hindgut，gonad，and liver.The IGF － Ⅱ mRNA was expressed during larval various development stages，the maximal expression in the newly hatched，and then reduced slightly.These findings may provide a molecular base for further knowledge of growth regulation.

Siniperca chuatsi;insulin－like growth factor－Ⅱ;gene expression

Q786

A

2095－1388(2012）06－0495－07

2012－03－20

上海市科委重點基礎(chǔ)項目 (09jc1406900）;上海市重點學(xué)科建設(shè)項目 (Y1101）

劉俊 (1983－），男，碩士研究生。E－mail:junliu1983@163.com

趙金良 (1969－），男，教授。E－mail:jlzhao@shou.edu.cn