楊靖亞 陸曉帆 王 珍

(上海海洋大學海洋科學研究院，上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海201306)

檢測副溶血弧菌TDH斑點免疫膠體金滲濾法的研究①

楊靖亞 陸曉帆 王 珍

(上海海洋大學海洋科學研究院，上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海201306)

目的:制備特異性檢測副溶血弧菌TDH的斑點免疫膠體金滲濾測試盒(Dot immunogold filtration assay，DIGFA)。方法:T6D4和T9H4兩株抗體分別標記于金顆粒和點樣于硝酸纖維素膜，通過雙抗體夾心法來開發(fā)斑點免疫膠體金滲濾測試盒，并對測試盒的特異性、重復性、穩(wěn)定性做了分析。結果:研制的斑點免疫膠體金滲濾測試盒能夠特異性檢測副溶血弧菌TDH，其最低檢測限達到250 ng/ml TDH，該測試盒在4℃恒溫條件下保存12周后仍表現出準確和穩(wěn)定的檢測結果。結論:成功制備了檢測副溶血弧菌TDH的斑點免疫膠體金滲濾測試盒，對現場快速檢測TDH提供了可靠的測試工具。

副溶血弧菌;耐熱直接溶血毒素;斑點免疫膠體金滲濾法;快速檢測

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus，Vp)是一種能引起食物中毒和旅游者腹瀉的嗜鹽性細菌，目前已知的副溶血弧菌有12種O抗原及59種K抗原，據其發(fā)酵糖類的情況可分為5個類型。各種弧菌對人和動物均有較強的毒力。食用蝦、蟹、貝類等水產品所致副溶血弧菌食物中毒，起病急驟，常有腹痛、腹瀉、嘔吐、失水、畏寒及發(fā)熱。腹痛多呈陳發(fā)性絞痛，常位于上腹部、臍周或回盲部。腹瀉每日3～20余次不等，大便性狀多樣，多數為黃水樣或黃糊便。約2%～16%呈典型的血水或洗肉水樣便，部分病人的糞便可為膿血樣或粘液血樣。由于吐瀉，患者常有失水現象，重度失水者可伴聲啞和肌痙攣，個別病人血壓下降、面色蒼白或發(fā)紺以至意識不清。近年來副溶血弧菌引起食物中毒的發(fā)生規(guī)模以及人群暴露規(guī)模呈明顯上升趨勢，已成為我國首要的食源性致病菌[1]。目前研究顯示，副溶血弧菌的主要致病因子是其產生的多種溶血毒素和尿素酶，分別有不耐熱溶血毒素(Thermolabile hemolysin，TLH)、耐熱直接溶血毒素(Thermostable direct hemolysin，TDH)、直接溶血相關毒素(TDH-related hemolysin，TRH)，其中耐熱直接溶血毒素TDH是主要的致病因子[2]。TDH是一種細胞毒素，該毒素是不含糖或脂質的蛋白質，由165個氨基酸殘基組成，富含天門冬酸和纈氨酸。其等電點約為4～5之間，最小和最大吸收光譜分別為250 nm和277 nm，分子量約46 kD，由兩個相同的亞基組成[3]。

目前，國內外對于已報道的副溶血弧菌TDH的檢測方法以多重PCR技術，熒光實時PCR技術，ELISA檢測技術為主[4-6]。然而，這些方法始終擺脫不了耗時、費力、經濟成本等不可避免的不足之處，在很大程度上限制了對于致病性副溶血弧菌在環(huán)境現場以及臨床快速預防檢測的實行，同時還考慮到這些方法對實驗員的操作上要求較高和繁瑣的儀器使用，根本不能夠被廣泛地運用于基層單位的檢測應用、不能夠達到真正意義的“快速”檢測效果。

免疫膠體金技術是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體檢測的一種新型免疫標記技術。用膠體金顆粒標記抗體或抗原，以檢測未知抗原或抗體的方法稱免疫膠體金技術。她不僅具備了免疫學中抗原與抗體特異性結合的特點，同時還可以通過金顆粒聚集后的顯色反應，最終能夠快速、準確地檢測出目的物，從采樣到獲得結果大約只需要10～15分鐘左右[7，8]，從而完全滿足副溶血弧菌TDH快速和操作簡單的檢測要求。

然而，國內外對于斑點免疫膠體金滲濾檢測法用于TDH的檢測未曾報道。因此，本文以期通過雙抗體夾心檢測原理結合于斑點免疫膠體金滲濾法，首次制備特異性針對副溶血弧菌TDH的快速檢測試劑盒，實現能夠滿足于現場快速檢測的要求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 硝化纖維膜NC購于Whatman公司;TDH由本實驗室制備所得;TDH單克隆抗體均由本實驗室制備所得;牛血清白蛋白BSA、四氯金酸HAuCl4、檸檬酸三鈉購置于Sigma公司;致病性副溶血弧菌ATCC33846(標準菌株)購于北京中原公司;沙門氏菌、大腸桿菌、單核細胞增多性李斯特菌、金黃色葡萄球菌、非致病性副溶血弧菌F188(從南美白對蝦分離出，只含TLH不含TDH，通過生理生化試驗和PCR分析，確定為非致病性副溶血弧菌)菌株均由上海海洋大學食品安全實驗室惠贈;所有的化學試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 TDH的制備 37℃條件下對致病性副溶血弧菌ATCC 33846進行搖床擴大培養(yǎng)16小時，8 000 r/min離心取上清去掉菌體，硫酸銨鹽析提取粗蛋白，然后依次經過 DEAE-纖維素、DEAE-Sephadex A-50、葡聚糖G-75層析純化TDH，冷凍干燥純化后的 TDH[9]，準確稱量，溶解于少量 pH7.4，0.01 mol/L的PBS中。

1.2.2 膠體金顆粒的制備 一株抗TDH單克隆抗體T6D4由實驗室制備所得，膠體金顆粒的制備過程根據文獻[10]所報道。首先，將盛有 100 ml 0.01%HAuCl4的燒杯置于恒溫磁力攪拌器徹底煮沸;隨之迅速加入1.7 ml新鮮配制的1% 檸檬酸三鈉;在不斷的攪拌中繼續(xù)加熱煮沸;待液體顏色轉變?yōu)榫萍t色后，追加煮沸5分鐘即可。最后制備所得膠體金溶液收集與棕色玻璃瓶，并保存在4℃冰箱中。膠體金顆粒大小通過紫外分光光度計進行檢測。

1.2.3 膠體金顆粒與待標記抗體的標記 對于膠體金顆粒與單克隆抗體的結合，單克隆抗體主要通過范德華力和疏水作用吸附于金顆粒表面[11]。在膠體金溶液中，金顆粒之間保持著靜電排斥與范德華引力的平衡狀態(tài)，然而一旦受到外界離子物質的干擾后，其平穩(wěn)體系將隨之破壞，范德華引力便會大大強于靜電排斥力，因此顆粒間將會發(fā)生聚集反應，溶液也會有紅色轉變?yōu)樗{色以至灰色。若當膠體金溶液中金顆粒伴隨著一定含量蛋白分子的吸附，此平衡不會被破壞，換言之，單克隆抗體將阻止該不穩(wěn)定狀態(tài)[12]，所以為了尋找最強的金顆粒與單克隆抗體的結合力，我們必須挑選出最佳的pH與抗體標記量。

最佳標記pH選擇:通過0.1 mol/L K2CO3對膠體金溶液進行 pH 調整，設置了 pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0 的不同梯度;分別取不同的 pH 膠體金溶液各1 ml于試管中，每管中均加入10 μl 1 mg/ml的TDH單克隆抗體T6D4，充分混勻后室溫靜置30分鐘;最后通過每管添加100 μl 10%NaCl (w/v)，根據溶液顏色的變化程度選出最佳標記pH，即膠體金溶液仍將保持為酒紅色。

最佳標記單克隆抗體量的選擇:通過0.1 mol/ L K2CO3對膠體金溶液進行最佳標記pH調整，取出1 ml膠體金溶液于各個玻璃試管中;每試管膠體金溶液中分別加入 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μl 1 mg/ml的待標記TDH單克隆抗體T6D4;充分混勻后室溫靜置30分鐘;最后通過每管添加100 μl 10%NaCl(w/v)，根據溶液顏色的變化程度選出最佳抗體標記量，即膠體金溶液仍將保持為酒紅色。

膠體金-抗體復合溶液的制備:本文對10 ml制備的膠體金溶液(0.1 mol/L K2CO3調整到 pH7.4)中加入120%最佳標記量的TDH單克隆抗體T6D4進行標記;在磁力攪拌器的作用下，室溫勻速攪拌60分鐘，使膠體金溶液中的金顆粒與待標記TDH單克隆抗體T6D4充分吸附平衡;隨后向膠體金復合物溶液中加入10%BSA(w/v)使復合物溶液中BSA的終濃度為1%，并在室溫勻速條件下繼續(xù)攪拌60分鐘;然后將膠體金復合物液體13 000 r/min離心60分鐘，仔細吸去上清液，最后用1 ml 0.01 mol/L PBS(含1%BSA)保存液重懸沉淀，并于4℃條件下保存。

1.2.4 斑點免疫膠體金滲濾檢測盒的組裝及使用1 μl 2 mg/ml單克隆抗體T9H4點樣于15 mm× 15 mm面積大小的NC膜中點處，作為檢測TDH的檢測點，隨后放置于37℃恒溫條件下干燥30分鐘;之后取出NC膜浸沒在2%BSA的PBS封閉液中，在4℃條件下過夜封閉處理;然后取出用超純水漂洗3次(30秒/次);最后在室溫條件下自然晾干即可，待測試盒組裝用。整個組裝我們只需在NC膜下墊放64層抽取式面紙，用一次性塑料測試卡上下包裹即可。

對于整個檢測過程包括以下步驟:滴加20 μl pH7.4 0.01 mol/L PBS(含 1%BSA)潤濕 NC 膜;滴加60 μl檢測樣本溶液，待滲透NC膜;滴加40 μl pH7.4 0.01 mol/L PBS(含 1%Tween-20、1% BSA)洗滌NC膜;待溶液完全滲入NC膜后，滴加60 μl膠體金-抗體復合溶液，待完全滲入;最后滴加60 μl PBS洗滌液洗滌NC膜，即完成整個檢測，耗時約為3分鐘。若最終NC膜上出現紅色斑點，說明檢測樣本中含有TDH，若無紅色斑點說明樣本為陰性。

1.2.5 斑點免疫膠體金滲濾測試盒的特異性試驗在37℃ 180 r/min恒定條件下，對副溶血弧菌(含TDH)、沙門氏菌、大腸桿菌、單核細胞增多性李斯特菌、金黃色葡萄球菌和非致病性副溶血弧菌F188菌株進行液體增菌搖床培養(yǎng)24小時后，對所有菌液進行8 000 r/min離心10分鐘，取上清液作為檢測樣本。

1.2.6 斑點免疫膠體金滲濾測試盒的靈敏度試驗

用PBS將純化的TDH毒素蛋白配置成不同的濃度，用測試盒進行檢測。

1.2.7 斑點免疫膠體金滲濾測試盒的重復性試驗對不同的樣本多次進行測試，用來檢驗滲濾檢測盒的結果重復性是否專一。

1.2.8 斑點免疫膠體金滲濾測試盒的穩(wěn)定性試驗將組裝好的滲濾檢測盒放在37℃、4℃恒溫條件下保藏1、4、8、12和16周之后再用于檢測樣本，以期檢驗其穩(wěn)定性。

2 結果

2.1 膠體金溶液的制備與金顆粒標記 通過檸檬酸三鈉還原法制備了膠體金溶液，通過紫外可見分光光度計在700～400 nm對膠體金溶液的全波長掃描，制備出了在520 nm處有最大吸收峰的金顆粒(圖1)。

通過最佳pH、標記量的摸索，確定了最佳標記條件為:pH7.4和4 μg TDH單克隆抗體T6D4/1ml膠體金溶液(圖2)。運用紫外可見光光度計進行了掃描驗證，溶液在535處有最大吸收峰(圖1)。

2.2 斑點免疫膠體金滲濾測試盒的特異性試驗按照制備的測試盒的操作步驟分別對ATCC33846 (含TDH)、沙門氏菌、大腸桿菌、單核細胞增多性李斯特菌、金黃色葡萄球菌和非致病性副溶血弧菌F188(含TLH、不含TDH)的上清液進行檢測，以確定所制備的DIGFA對TDH檢測的特異性。如圖3所示，該檢測盒呈現出了良好的特異性檢測結果。

圖1 膠體金溶液標記前后的紫外分光光度計波長掃描Fig.1 UV-visible spectra of colloidal gold and antibodygold conjugates

圖2 最佳抗體標記量的分析Fig.2 Optimal condition of antibody concentration for coating

圖3 斑點免疫膠體金滲濾測試盒的特異性分析Fig.3 The analysis of DIGFA specificity

圖4 斑點免疫膠體金滲濾測試盒的最低檢測限Fig.4 The lowest detection limit of DIGFA

圖5 斑點免疫膠體金滲濾測試盒的重復性試驗Fig.5 The repeatability assay of DIGFA

表1 斑點免疫膠體金滲濾測試盒的穩(wěn)定性實驗結果Tab.1 The stability of DIGFA for detection

圖6 斑點免疫膠體金滲濾測試盒對于最低檢測限的穩(wěn)定性評價Fig.6 The stability evaluation on the lowest detection limit of DIGFA

2.3 斑點免疫膠體金滲濾測試盒的靈敏度試驗按照制備的測試盒的操作步驟進行檢測，將1 mg/ ml的 TDH 檢測樣本用 pH7.4，0.01 mol/L PB 溶液梯度稀釋，確定DIGFA的最低檢測限(圖4)為250 ng/ml TDH。

2.4 斑點免疫膠體金滲濾測試盒的重復性試驗每次樣本檢測均設置了3個平行對照，結果(圖5)始終表現均一。

2.5 斑點免疫膠體金滲濾測試盒的穩(wěn)定性試驗在4℃和37℃兩種保藏條件下，分別在保藏1、4、8、12、16周之后用于對250 ng/ml TDH的陽性樣本進行檢測，結果穩(wěn)定性如(表1和圖6)所示，明確肯定了該檢測試劑盒最佳保存期為4℃密封條件下12周。

3 討論

副溶血弧菌耐熱直接溶血毒素TDH作為最主要的致病因子，對于廣大熱衷于海產品的民眾的食品安全衛(wèi)生而言直接產生了相當大的負面作用。雖然，國內已大量報道了副溶血弧菌的檢測方法其中主要有PCR檢測技術、ELISA檢測技術等。檢測時間也從6～8小時不等。Blackstone等[13]對致病性副溶血弧菌的TDH基因的設計了引物5′-AAA CAT CTG CTT TTG AGC TTCCA-3′＆5′-CTC GAA CAACAA ACA ATATCT CAT CAG-3′和 熒 光 探 針 5′-FAM-TGT CCC TTT(T)CC TGC CCCCGG-3′，建立了熒光實時PCR技術，對12種不同細菌株進行檢測，結果表明僅含有TDH的副溶血弧菌產生了單個熒光信號，而不含TDH的弧菌或非弧菌菌株都無任何熒光反應，實驗特異性強，靈敏度也高。竇勇等[6]以副溶血弧菌1.216 4作為抗原，免疫新西蘭兔，獲得效價為1.6×105的多克隆抗體;以此多克隆抗體作為一抗，山羊抗兔IgG-HRP作為酶標二抗，建立副溶血弧菌的間接ELISA快速檢測法。但是，其方法的檢測時間較長不能夠滿足快速在環(huán)境現場的或是臨床的檢測應用，不利于進行基層的推廣使用。

因次，本文通過免疫學檢測原理研制了斑點免疫膠體金滲濾法用來專一性檢測TDH的快速檢測盒，總耗時僅為3分鐘。相對于目前針對TDH檢測的已報道方法而言，在檢測時間上達到了質的飛躍，此外，選用該法在檢測試驗中，步驟簡便操作簡單，不涉及任何儀器，只需通過肉眼的觀察便可得出試驗結果。同時該試劑盒最低檢測限達到250 ng/ml TDH，還表現出了良好的穩(wěn)定性與重復性，并在4℃恒溫條件下保存12周后仍可以使用，無出現結果偏差。

目前，國內對于檢測副溶血弧菌TDH的斑點免疫膠體金滲濾法開發(fā)的尚無報道，所以本文的研制為滿足基層大批量在環(huán)境現場或是臨床的快速檢測上提供了可靠的工具。

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[收稿2011-11-20 修回2012-04-25]

(編輯 許四平)

Development of dot-immunogold filtration assay to detect TDH produced by Vibrio parahaemolyticus

YANG Jing-Ya，LU Xiao-Fan，WANG Zhen.Ocean Science Institution Research Institute，Shanghai Ocean University，Shanghai Engineering Center for Processing and Storage of Acquatic Product，Shanghai 201306，China

Objective:To develop a Dot immunogold filtration assay to especially detect TDH(thermostable direct hemolysin) produced by vibrio parahaemolyticus.MethodsT6D4 and T9H4 were coated to nanogold and ejected onto nitrocellulose filter membrane respectively.We developed the test kit via sandwich assay with double-antibodies，and analyzed its specificity，repeatablity and stability.ResultsThe DIGFA kit could especially detect TDH at the lowest level of 250 ng/ml.It also exhibited exact and stable testing result after 12 weeks later stored under 4℃.ConclusionThe study successfully developed the DIGFA kit，which could be widely applied into detect TDH rapidly on the scene.

Vibrio parahaemolyticus;Thermostable direct hemolysin;Dot immunogold filtration assay;Rapid detection

R392.12

A

1000-484X(2012)08-0733-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2012.08.013①本文為上海市科委工程中心建設項目(11DZ2280300)及上海市教育委員會重點學科建設項目(J50704)

楊靖亞(1976年-)，女，博士，副教授，主要從事海洋生物資源綜合利用與海洋藥物的開發(fā)、腫瘤藥理學方面的研究，E-mail:jyyang@shou.edu.cn。

·實用臨床免疫學·