蔡文博 李 行 武永淑 楊 柳 張 偉 韓凌霞

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150001)

兩種MHC-B單倍型雞群在發(fā)育過程中四種細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平的變化①

蔡文博 李 行 武永淑 楊 柳 張 偉 韓凌霞

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150001)

目的:從分子水平探討雞免疫系統(tǒng)的個(gè)體發(fā)生學(xué)。方法:利用雙重?zé)晒舛縍T-PCR(dqRT-PCR)技術(shù)，對(duì)14～35日齡主要組織相容性復(fù)合體(MHC)單倍型雞品系G2(B15單倍型)和G5系(B5單倍型)雞群的肺組織(包括氣管)、脾臟和外周血淋巴細(xì)胞(PBL)中IFN-γ、IL-18、IL-4和IL-10的mRNA含量進(jìn)行定量檢測(cè)。結(jié)果:隨日齡增長(zhǎng)，兩雞群脾臟中IFN-γ轉(zhuǎn)錄水平升高，PBL中IL-18和IL-10整體下降。G5系雞群脾臟中IFN-γ轉(zhuǎn)錄水平始終高于肺組織和PBL。兩雞群脾臟中IL-18轉(zhuǎn)錄水平均高于肺組織和PBL，脾臟中IL-4在孵化后早期轉(zhuǎn)錄水平較高，而肺組織中則出現(xiàn)較晚。兩雞群肺組織、脾臟和PBL中IL-10均在35日齡降到最低。結(jié)論:14～35日齡無特定病原體(SPF)雞脾臟中IFN-γ轉(zhuǎn)錄水平隨生長(zhǎng)發(fā)育而增多，而肺組織和PBL中未見明顯隨生長(zhǎng)發(fā)育變化的規(guī)律;PBL中IL-18和IL-10轉(zhuǎn)錄水平隨生長(zhǎng)發(fā)育而下降;18～35日齡，肺組織、脾臟和PBL中IL-10轉(zhuǎn)錄水平均隨日齡增長(zhǎng)而降低;不同MHC-B單倍型雞群細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平受日齡調(diào)節(jié)相似。

IFN-γ;IL-18;IL-4;IL-10;MHC;雙重?zé)晒舛縍T-PCR

禽類免疫系統(tǒng)的發(fā)育及功能的發(fā)揮與日齡密切相關(guān)，特別是T細(xì)胞的分化和發(fā)育。禽類肺臟免疫系統(tǒng)是抵御呼吸道病原體的第一道防線，在先天性免疫應(yīng)答中具有重要作用。不同發(fā)育階段，肺粘膜上含有的細(xì)胞數(shù)量有很大區(qū)別。脾臟作為二級(jí)淋巴器官，在誘導(dǎo)抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，抵御胸腺依賴性抗原中具有重要作用[1]。脾臟中的T細(xì)胞隨著生長(zhǎng)發(fā)育而增多，其中，胚胎期增殖較少，孵化后早期增加迅速[2，3]。血液作為特殊類型的結(jié)締組織，在血漿和組織液間進(jìn)行持續(xù)的物質(zhì)和細(xì)胞運(yùn)輸，其中的白細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中重要的組成部分，在血液中僅存在12～20小時(shí)，隨后離開循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入組織，發(fā)揮功能。

雞主要組織相容性復(fù)合體(Major histocompatablity complex，MHC)是雞的免疫遺傳相關(guān)基因，與疾病抗性或易感性有關(guān)。G2系和G5系雞群是MHC特異單倍型無特定病原體(Specific pathogen free，SPF)雞群，分別屬于B15和B5單倍型。B5單倍型雞群的抗病能力較差，對(duì)馬立克氏病(Marek’s disease，MD)、傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)、禽白血病(Avian leucosis，AL)及勞氏肉瘤病(Rous sarcoma，RS)均易感[4];B15 單倍型雞群對(duì)MD的抵抗能力相對(duì)較強(qiáng)[5]。

本試驗(yàn)以G2系和G5系SPF雞群為試驗(yàn)對(duì)象，通過檢測(cè)不同發(fā)育階段，兩雞群肺組織、脾臟和外周血淋巴細(xì)胞(PBL)中 IFN-γ、IL-18、IL-4和 IL-10 的mRNA含量，從分子轉(zhuǎn)錄水平探討雞免疫系統(tǒng)的個(gè)體發(fā)生學(xué)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、感受態(tài)細(xì)胞 40周齡SPF成年雞，7日齡BW系列G2系和G5系SPF雞由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所培育提供，使用許可證編號(hào)為SYXK黑(2006-)。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞TG1由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 雞淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司;Hank′s平衡鹽溶液、改良型RPMI1640培養(yǎng)基、優(yōu)級(jí)胎牛血清(FBS)購(gòu)自Hyclone公司;Concanavalin A(ConA)購(gòu)自Solarbio公司;RNA Isoplus、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、dNTP Mixture(10 mmol/L)、Ex Taq 酶、20 bp DNA Ladder Marker、pMD-18T 載體、X-Gal、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、Premix Ex TaqTM等均購(gòu)自大連寶泰克生物工程有限公司;膠回收試劑盒購(gòu)自上海華舜生物技術(shù)有限公司;質(zhì)粒小量提取試劑盒E.Z.N.A Plasmid Mini KitⅡ購(gòu)自美國(guó) OMEGA 公司。

1.3 dqRT-PCR引物及探針的合成 以28s rRNA為內(nèi)參基因，分別建立雞IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-18基因的 dqRT-PCR 方法。IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-18和28s rRNA的引物及熒光素標(biāo)記探針參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)合成[6-10]，見表1。引物和探針均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 目的基因及內(nèi)參基因的克隆 無菌采集成年SPF雞翅靜脈血，肝素鈉抗凝，按照產(chǎn)品說明書分離外周血淋巴細(xì)胞。即將抗凝血與等體積Hank′s液混勻，加至等體積雞淋巴細(xì)胞分離液上方，2 000 r/ min，室溫離心15分鐘;吸取中間淋巴細(xì)胞層，1 500 r/min，室溫離心10分鐘收集細(xì)胞。用RPMI1640培養(yǎng)基洗滌2次。加入終濃度為25 μg/ml的ConA作為刺激劑，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36小時(shí)。收獲細(xì)胞，參照RNA isoplus試劑說明書提取總RNA。參照M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶說明書進(jìn)行隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄。以cDNA為模板，分別PCR擴(kuò)增IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-18和28s rRNA基因，反應(yīng)條件均為:95℃，5分鐘;94 ℃，20秒，60 ℃，30秒，72 ℃，30秒，30個(gè)循環(huán);72℃，10分鐘。膠回收各基因的擴(kuò)增片段。參照說明書，將各基因的回收產(chǎn)物分別連接于pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化于TG1感受態(tài)細(xì)胞。將PCR鑒定大小正確的重組質(zhì)粒在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所基礎(chǔ)與技術(shù)服務(wù)部進(jìn)行測(cè)序。用MEGA 4.0軟件對(duì)序列測(cè)定結(jié)果與GenBank中的參考序列比對(duì)分析。測(cè)序正確的各重組質(zhì)粒分別命名為p-IFN-γ、p-IL-4、p-IL-10、p-IL-18 和 p-28s rRNA。

表1 雙重?zé)晒舛縋CR的引物和探針序列Tab.1 Primers and probes sequence of duplex quantitative PCR

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定各質(zhì)粒的濃度和純度，并參考以下公式計(jì)算基因的拷貝數(shù):單位體積質(zhì)粒拷貝數(shù)(copies/μl)=6.023×1023(copies/ mol)×C(g/μl)/堿基數(shù)×660(g/mol)。將重組質(zhì)粒用 TE 稀釋至 1.0 ×1010拷貝/μl，p-IFN-γ、p-IL-4、p-IL-10 和p-IL-18 各取10 μl，分別與10 μl p-28s rRNA 一同加入80 μl的ddH2O中，漩渦振蕩充分混勻后，吸取10 μl至90 μl的 ddH2O 中，依次 10 倍倍比稀釋至1.0 ×101拷貝/μl，以101～1010拷貝/μl質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用Bio/Rad IQ5定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。各基因的反應(yīng)體系均為25 μl，反應(yīng)條件為:95 ℃，30秒;94℃，20秒，60 ℃，1分鐘，40個(gè)循環(huán)。

1.6 G2系和G5系雞群細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平動(dòng)態(tài)分析 7日齡G2系(18羽)和G5系(20羽)SPF雛雞飼養(yǎng)于負(fù)壓隔離器內(nèi)，分別于 14、15、16、18、24和35日齡從兩雞群中取出3～5羽，采集翅靜脈抗凝血，分離PBL(B);利用CO2將雞窒息致死后，摘取氣管及肺臟(L)，分離單細(xì)胞，具體操作如下:將摘取的肺臟和氣管置于預(yù)冷的PBS中洗滌，在一平皿上方放置一塊200目銅網(wǎng)，加入5 ml預(yù)冷的Hank′s平衡鹽溶液，將肺臟和氣管移至銅網(wǎng)上，一并剪碎，用20 ml注射器尾部進(jìn)行充分研磨，使之透過銅網(wǎng)成單細(xì)胞，在15 ml離心管中加入5 ml雞淋巴細(xì)胞分離液，將制備好的單細(xì)胞懸液沿管壁緩慢加于分離液之上，2 000 r/min，離心15分鐘，吸取中間云霧層于新的離心管中，4℃，8 000 r/min，離心2分鐘，棄上清即得;采集脾臟(S)約100 mg，剪碎并用研磨棒充分研磨。分別提取各處理后組織總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到 cDNA，用于 IFN-γ、IL-4、IL-10 和 IL-18 mRNA含量的檢測(cè)。計(jì)算目的基因與內(nèi)參基因的比值，利用SAS軟件中的LSD法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的擴(kuò)增 利用IFN-γ、IL-18、IL-4、IL-10和28s rRNA的特異性引物，從SPF雞PBL中擴(kuò)增獲得特異的條帶，大小與預(yù)期符合，圖略。

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定 分別從重組質(zhì)粒p-IFN-γ、p-IL-18、p-IL-4、p-IL-10和 p-28s rRNA 中擴(kuò)增出71、94、98、94和62 bp的特異性條帶，與預(yù)期大小相符，見圖1。使用MEGA 4.0軟件對(duì)測(cè)得的重組質(zhì)粒p-IFN-γ、p-IL-18、p-IL-4、p-IL-10 和 p-28s rRNA 的核苷酸序列分別與GenBank中登錄的參考序列NM205149、BM489174、NM_001007079、EF554720 和X59733進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，所有克隆的目的基因序列均與各自的參考序列完全一致，同源性為100%。

2.3 dqRT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 分別將p-IFN-γ、p-IL-18、p-IL-4和p-IL-10重組質(zhì)粒與p-28s rRNA質(zhì)粒混合，依次進(jìn)行10倍倍比稀釋，取濃度范圍在101～1010拷貝/μl的混合質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，各擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增曲線均呈標(biāo)準(zhǔn)的“S”型，目的基因與內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率相近，且均呈良好的線性關(guān)系，如圖2。

2.4 G2和G5系雞群3種組織中IFN-γ轉(zhuǎn)錄水平的動(dòng)態(tài)變化 兩雞群同一被檢組織中IFN-γ轉(zhuǎn)錄水平隨日齡變化的趨勢(shì)大體一致，脾臟中IFN-γ水平整體隨日齡增長(zhǎng)而升高，且?guī)缀跏冀K高于肺組織和PBL，而肺組織和PBL中無明顯隨日齡變化的規(guī)律。G2雞群PBL中IFN-γ轉(zhuǎn)錄水平基本一直低于肺組織和脾臟，14日齡時(shí)其3種被檢組織中IFN-γ轉(zhuǎn)錄水平相近，35日齡時(shí)出明顯差異，即脾臟＞肺組織＞PBL;G5雞群24日齡時(shí)PBL中IFN-γ顯著高于15日齡(P＜0.05)，極顯著高于18和35日齡(P ＜0.01)，如圖3A。

2.5 G2和G5系雞群3種組織中IL-18轉(zhuǎn)錄水平的動(dòng)態(tài)變化 兩雞群脾臟中IL-18轉(zhuǎn)錄水平均始終高于肺組織和PBL，G2雞群脾臟中IL-18在24日齡時(shí)最低，而此時(shí)G5系最高。兩雞群肺組織中IL-18均保持較平穩(wěn)態(tài)勢(shì)。隨日齡增長(zhǎng)，兩雞群PBL中 IL-18呈下降趨勢(shì)，15～35日齡期間各時(shí)間點(diǎn)IL-18轉(zhuǎn)錄水平均較14日齡顯著降低(P＜0.05)，如圖3B。

圖1 重組質(zhì)粒的PCR鑒定Fig.1 PCR identification of recombinant plasmid

圖2 各目的基因質(zhì)粒與內(nèi)參基因質(zhì)粒雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Duplex quantitative PCR amplification and standard curves for target gene and reference gene plasmids

2.6 G2和G5系雞群3種組織中IL-4轉(zhuǎn)錄水平的動(dòng)態(tài)變化 兩雞群各被檢組織中IL-4轉(zhuǎn)錄水平極低，脾臟中IL-4在15日齡時(shí)相對(duì)較高，其中G2雞群達(dá)到顯著水平(P＜0.05)。兩雞群肺組織中IL-4轉(zhuǎn)錄水平在35日齡時(shí)最高，如圖3C。

2.7 G2和G5系雞群3種組織中IL-10轉(zhuǎn)錄水平的動(dòng)態(tài)變化 兩雞群PBL中IL-10轉(zhuǎn)錄水平隨日齡增長(zhǎng)呈整體下降趨勢(shì)，由14日齡高于其它被檢組織，到35日齡降至最低。14～16日齡，兩雞群肺組織中IL-10轉(zhuǎn)錄水平有所升高，但隨后開始下降。14～18日齡，兩雞群脾臟中IL-10轉(zhuǎn)錄水平上下波動(dòng)，18日齡后迅速下降，如圖3D。

3 討論

兩雞群脾臟中IFN-γ轉(zhuǎn)錄水平隨日齡增長(zhǎng)而升高，G5雞群脾臟中IFN-γ水平高于PBL的結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[11，12]。脾臟中T細(xì)胞的積聚與脾臟的生長(zhǎng)和發(fā)育有關(guān)，T細(xì)胞隨脾臟的生長(zhǎng)而增多，胚胎期增殖較少，孵化后早期增多迅速?？赡苷蛉绱?，在14～35日齡期間，以35日齡時(shí)的轉(zhuǎn)錄水平最高，這與T細(xì)胞數(shù)量增多成正相關(guān)。Lowenthal等人在研究孵化后早期雞脾臟中T細(xì)胞數(shù)量時(shí)發(fā)現(xiàn)，孵化后第4天和第7天脾臟中CD3+T細(xì)胞含量與孵化后第1天相比分別增長(zhǎng)了18倍和73倍，CD4+T細(xì)胞分別增加了4.5倍和8倍，CD8+T細(xì)胞含量也隨著脾臟的發(fā)育而增多。Seto比較19胚齡和2～9日齡雞的免疫功能時(shí)發(fā)現(xiàn)，8日齡雞脾臟產(chǎn)生的免疫應(yīng)答水平高于低日齡的雞及雞胚。1～7日齡雞脾臟中T細(xì)胞數(shù)量的增加，也與在有絲分裂原的刺激下脾臟中IFN-γ含量的增加有關(guān)[11]。本研究中35日齡時(shí)，G2和G5雞群脾臟中IFN-γ轉(zhuǎn)錄水平較14日齡分別增長(zhǎng)了88.2倍和76.4倍。14日齡時(shí)G2雞群肺組織、脾臟和PBL中IFN-γ轉(zhuǎn)錄水平相近，35日齡時(shí)出明顯差異，即脾臟＞肺組織＞PBL，說明脾臟作為免疫器官，其區(qū)別于其它組織的特性及其特有功能的發(fā)揮隨發(fā)育成熟而表現(xiàn)得日趨明顯。

圖3 G2和G5系雞群肺組織、脾臟和外周血淋巴細(xì)胞中細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平Fig.3 Cytokine transcript levels in lungs，spleens and PBL of lines G2 and G5 birds

兩雞群脾臟中IL-18轉(zhuǎn)錄水平均高于肺組織和PBL，G2和G5雞群分別在35和24日齡時(shí)水平最高，與 Abdul-Careem等人[12]報(bào)道的脾臟中 IL-18 mRNA含量隨日齡增大而增多的結(jié)果相似，可能與脾臟免疫功能的發(fā)揮有關(guān)。同時(shí)，也說明不同MHC單倍型雞同一免疫器官的發(fā)育或其細(xì)胞因子的分泌并非完全一致。然而，PBL中IL-18轉(zhuǎn)錄水平隨日齡增大呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

哺乳動(dòng)物胚胎期和新生期，淋巴器官中的細(xì)胞因子種類尚不齊備，但此時(shí)Th2型細(xì)胞因子含量豐富，雞胚中IL-4 mRNA含量高于孵化后的雞[12]。本研究中，兩雞群脾臟中IL-4在15日齡時(shí)最高，PBL中IL-10轉(zhuǎn)錄水平隨日齡增長(zhǎng)呈整體下降趨勢(shì)，肺組織和脾臟中IL-10也均在35日齡時(shí)降到最低，與前人的結(jié)論一致。此外，IL-4在不同組織中聚集的時(shí)期不同，脾臟主要在孵化后早期聚集較多，而肺臟中則出現(xiàn)較晚。

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[收稿2012-01-10 修回2012-05-28]

(編輯 張曉舟)

The transcription level of four kinds of cytokines in two MHC-B haplotypes chickens in the development

CAI Wen-Bo，LI Hang，WU Yong-Shu，YANG Liu，ZHANG Wei，HAN Ling-Xia.State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology，Harbin Veterinary Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Harbin 150001，China

Objective:To investigate the ontogeny of chicken immune system.MethodsIFN-γ，IL-18，IL-4 and IL-10 mRNA was isolated from lungs，spleens and peripheral blood lymphocytes(PBL)of genetically defined lines G2(B15/B15 haplotype)and G5(B5/B5 haplotype)chickens(14 to 35 days old)，and the levels in samples were detected by duplex quantitative real-time reverse transcription polymerase chain(dqRT-PCR)assay.ResultsIFN-γ in spleens was increased with growth，while IL-18 and IL-10 in PBL were in the opposite.IFN-γ in spleens of line G5 was higher than that in lungs and PBL all the time.IL-18 in spleens of both lines was higher than that in lungs and PBL.IL-4 in spleens was higher during the early posthatch period，but later in the lungs.IL-10 in the lungs，spleens and PBL of both lines were declined to the lowest at the 35 days old.ConclusionIFN-γ in spleens of SPF chickens (14 to 35 days old)increased with growth，but no obvious discipline shown in lungs and PBL;IL-18 and IL-10 in PBL decreased with growth.IL-10 in lungs，spleens and PBL was decreased with growing from 18 to 35 days old.The transcription level of cytokines in different MHC-B haplotype chickens were regulated similarly by the age.

IFN-γ;IL-18;IL-4;IL-10;MHC;dqRT-PCR

S852.4

A

1000-484X(2012)08-0722-06

10.3969/j.issn.1000-484X.2012.08.011①本文為中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(2009-08)和獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(NKLVBP2008)

蔡文博(1984年-)，女，碩士，主要從事動(dòng)物傳染病防治技術(shù)研究，E-mail:happybocai2008@163.com;

及指導(dǎo)教師:韓凌霞(1971年-)，女，博士，副研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事免疫遺傳學(xué)研究，E-mail: hlx1993@126.com。

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