張譽藝 屈 靜 張 建 (山東大學藥學院免疫藥理與免疫治療學研究所，濟南250012)

TLR4活化對肝癌細胞H7402生物學特征的影響①

張譽藝 屈 靜 張 建 (山東大學藥學院免疫藥理與免疫治療學研究所，濟南250012)

目的:分析TLR4在肝癌細胞H7402的表達水平，研究其活化對腫瘤細胞生物學功能、炎癥應答以及對化療藥物治療的影響。方法:RT-PCR方法檢測肝癌細胞TLR4基因、細胞凋亡和細胞周期相關基因的表達水平。LPS作用于肝癌細胞后，利用MTT法檢測細胞增殖，AnnexinV/PI雙染法檢測細胞凋亡，熒光定量PCR法檢測腫瘤相關細胞因子的表達水平，流式細胞術檢測腫瘤細胞表面淋巴細胞受體的配體及CyclinD1表達，Western blot檢測Bcl-xl表達水平。結果:TLR4在人肝癌細胞系HepG2、H7402、PLC/PRF/5中都有表達，LPS能促進肝癌細胞系的增殖，抵抗順鉑的抗腫瘤作用。進一步的機制研究表明，LPS能上調肝癌細胞周期相關分子CyclinD1、凋亡相關分子Bcl-xl的表達，并下調Fas的表達、上調腫瘤相關的炎癥因子的表達。結論:LPS誘導肝癌細胞H7402表達炎癥因子、促進腫瘤細胞的增殖，導致腫瘤細胞對化療藥順鉑產生抵抗作用。

肝癌;TLR4;順鉑;增殖;炎癥因子

Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)是一種模式識別受體，主要表達在免疫細胞上，特別是抗原遞呈細胞，包括B細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞等[1]。近些年來人們發(fā)現，TLRs也表達在一些非免疫細胞上，其中包括腫瘤細胞，例如肝癌、胃癌、結腸癌等[2-4]，表達在腫瘤細胞上的TLRs與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。研究表明，TLR激動劑在激活免疫系統(tǒng)的同時對腫瘤細胞也起著一定的作用。某些TLR激動劑能夠抑制腫瘤生長，例如，用鞭毛蛋白活化乳腺癌細胞的TLR5后能夠抑制細胞增殖從而抑制腫瘤的生長[5];但是，也有很多TLR激動劑對腫瘤的發(fā)生發(fā)展有一定的促進作用，例如，人頭頸部鱗癌細胞系上的TLR4被激活后能夠促進腫瘤的發(fā)展，并保護腫瘤細胞逃逸免疫攻擊[6]。另外，表達在腫瘤細胞的TLRs被激活后，腫瘤細胞通過分泌免疫抑制因子抑制抗原遞呈細胞的功能，并分泌促炎因子誘導慢性炎癥;同時通過誘導抗凋亡蛋白表達，對化療藥產生抗藥性，促進腫瘤細胞自身的生長[7]。因此，TLR激動劑被稱為“雙刃劍”。研究TLR激動劑對腫瘤的直接作用，對于TLR激動劑的應用具有很重要的意義。

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，在中國每年肝癌死亡人數達160萬人，由肝癌引起的死亡率位居第三，對人類健康和生存產生了巨大的威脅，因此急需尋找有效的治療方式。目前，由于肝癌的惡性程度高，手術切除率低，預后極差，藥物治療是主要的姑息治療手段。TLR4在肝癌細胞上表達水平、其活化對腫瘤細胞生物學功能的改變以及對化療藥物的治療是否產生影響，是本文主要探究的問題。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人肝癌細胞系HepG2、H7402、PLC/ PRF/5均購自中國科學研究院(上海，中國)，并在本實驗室保存。

1.1.2 試劑 RPMI1640購于Gibco公司;胰酶購自上海生工生物工程有限公司;新生牛血清購自杭州四季青公司;MTT、LPS購于Sigma公司;DMSO購于上海生工生物工程技術服務有限公司;Trizol、MMLV逆轉錄酶試劑盒購自美國 Invitrogen公司; SYRB Green Mix購自日本TOYOBO公司;Easy Taq DNA Polymerase購自TRANSGEN公司;流式抗體MICA/B、ULBP2、ULBP4、CD54、Fas、CyclinD1 等抗體購自美國BD公司;Western blot抗體Bcl-xl購自Bioworld公司;三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇等其他試劑為國產分析純，引物由北京華大基因有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及細胞干預 細胞系 HepG2、H7402、PLC/PRF/5以含有10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5%CO2的條件下。將細胞接種于12孔板中，待細胞貼壁后，換取無血清培養(yǎng)基使其饑餓12小時，再換取有血清培養(yǎng)基并加入10 μg/ml LPS刺激6～24小時，然后進行下一步檢測。

1.2.2 細胞增殖實驗 用MTT比色法檢測細胞增殖。將0.5×104個肝癌細胞接種于96孔板，用不同濃度的LPS刺激24小時，終止培養(yǎng)前每孔加入20 μl MTT(10 mg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)4小時，以2 500 r/min的轉速離心20分鐘，棄去上清，每孔加入200 μl DMSO混勻，使甲瓚顆粒溶解。用酶標儀(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)在570/630 nm的波長下測其吸光度。

1.2.3 順鉑對LPS處理的腫瘤細胞的作用 將H7402細胞接種于96孔板，每孔0.5 ×104個，100 μl，待細胞貼壁后，每孔加入 100 μl(20 μg/ml)的LPS，使其作用的終濃度達到10 μg/ml，同時設培養(yǎng)基對照組，待其作用12小時后，加入5～20 μg/ml順鉑，繼續(xù)作用48小時，MTT比色法檢測各組細胞增殖情況。

1.2.4 AnnexinV/PI雙染法檢測細胞凋亡 將1× 105個H7402細胞接種于12孔板，以10 μg/ml濃度的LPS作用12小時，加入10 μg/ml順鉑，繼續(xù)作用10小時;各組收集細胞，1 000 r/min離心5分鐘;用預冷的PBS洗一遍，棄去上清;用200 μl結合緩沖液將細胞重懸，每管加2 μl Annexin-V/FITC室溫避光孵育15分鐘，再加入5 μl 20 μg/ml PI溶液室溫避光孵育5分鐘;上機檢測。

1.2.5 RT-PCR Trizol法提取細胞總 RNA，方法參照Trizol說明書。將總RNA逆轉錄成cDNA并參照之前的方法進行PCR[8]。將PCR獲得的產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，用AlphaEaseFC儀拍照并進行光密度分析。PCR所用到的引物的序列及產物大小見表1。

1.2.6 熒光定量 PCR 炎癥相關基因 TNF-α、IL-6、IL-8、VEGF、免疫抑制因子 TGF-β 的表達情況采用熒光定量PCR的方法檢測。該方法使用SYBR Green Master Mix染色，iCycleriQ real-time PCR儀進行檢測。所用到的引物序列見表2。

1.2.7 流式細胞術檢測細胞表面分子表達 收集細胞，1×PBS清洗一遍。200 μl PBS重懸細胞，混勻，加入1 μl抗體，陰性對照管加入IgG，室溫避光孵育1小時。1×PBS清洗一遍，200 μl PBS重懸細胞，上機檢測。

1.2.8 Western blot檢測Bcl-xl表達 收集細胞加入蛋白裂解液提取總蛋白，BSA法繪制蛋白濃度標準曲線，測定提取的蛋白濃度。按照30 μg蛋白/泳道上樣，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，電轉移90分鐘至PVDF濾膜，5%脫脂奶粉封閉3小時;加入兔源抗Bcl-xl一抗(1∶500)，37℃孵育2小時;TBST漂洗3次，加羊抗兔二抗(1∶2 000)，37℃孵育1小時;TBST漂洗3次，每次10分鐘;化化學發(fā)光法顯色后用Bio-Rad成像系統(tǒng)成像。

表1 PCR擴增所用的引物及其序列Tab.1 The primer sequences used for the PCR amplification

1.3 統(tǒng)計學方法 兩組數據間比較采用成對t檢驗。P ＜0.05認為有顯著性差異。

2 結果

2.1 TLR4在肝癌細胞中的表達 通常TLR表達在免疫細胞，例如巨噬細胞和樹突狀細胞，然而TLR在其他種類的細胞中也可能發(fā)揮作用。為了研究

圖1 TLR4在肝癌細胞中的表達Fig.1 The expression of TLR4 on hepatocellular carcinoma cells

圖2 LPS對肝癌細胞的促增殖作用Fig.2 LPS promoted the proliferation of hepatocellular carcinoma cells

TLR4在肝癌細胞中的表達情況，我們采用RT-PCT的方法檢測肝癌細胞系HepG2、H7402、PLC/PRF/5中TLR4的基因表達水平。圖1顯示，所檢測的三種肝癌細胞均有TLR4基因表達。

2.2 TLR4激動劑LPS能肝癌細胞增殖 為了研究TLR4活化后對肝癌細胞的影響，我們選用了TLR4激動劑LPS。首先，用MTT比色法檢測LPS對肝癌細胞增殖的影響。將不同濃度的(0.312 5～20 μg/ml)LPS加入到肝癌細胞中作用24小時，檢測吸光度計算增殖率。如圖2所示，LPS對肝癌細胞HepG2及H7402都有顯著的促增殖作用，其中對H7402細胞的促增殖作用更為顯著，當LPS劑量為20 μg/ml時，其增殖率達到 122.43%。

2.3 TLR4活化對順鉑抗肝癌效應的影響 順鉑通過誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖。為了闡明肝癌細胞TLR4的活化對順鉑的治療作用是否有影響，我們首先用10 μg/ml的LPS預刺激肝癌細胞系H7402 12小時，再加入5～20 μg/ml的順鉑作用48小時，MTT比色法檢測細胞的增殖水平。圖3A顯示，經LPS預刺激的細胞再加入順鉑，其OD值要高于順鉑單獨作用組。進一步用AnnexinV/PI雙染法在H7402細胞中檢測到LPS預處理能削弱順鉑誘導細胞凋亡的作用(圖3B)，順鉑誘導細胞早期凋亡率下降了近50%，說明LPS能抵抗順鉑誘導的細胞凋亡作用。

圖3 LPS對順鉑誘導的肝癌細胞增殖抑制的影響Fig.3 The influence of LPS on Cisplatin induced the proliferation inhibition of hepatocellular carcinoma cells

2.4 LPS對腫瘤細胞周期、凋亡相關基因的調節(jié)為了研究LPS促進肝癌細胞增殖的機制，我們利用RT-PCR的方法檢測LPS刺激后周期相關分子CyclinE1、CyclinD1、C-myc 及凋亡相關分子 Bcl-xl、Mcl-1的表達。圖4A顯示，H7402細胞經LPS刺激后，CyclinD1、Bcl-xl的表達水平顯著上調，CyclinE1、C-myc、Mcl-1沒有明顯變化;進一步用流式細胞術和Western blot方法分別驗證了CyclinD1、Bcl-xl的蛋白表達水平也在LPS作用后上調(圖4B)。

2.5 LPS對腫瘤細胞炎癥相關基因的調節(jié) 在腫瘤微環(huán)境中，炎癥因子能夠促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展;免疫抑制細胞因子則抑制免疫細胞的功能，從而促進腫瘤的發(fā)展。為了研究LPS作用于肝癌細胞后對炎癥因子的表達是否有影響，我們采用熒光定量PCR的方法檢測H7402細胞經LPS刺激12小時后TNF-α、IL-6、IL-8、VEGF、TGF-β 的表達水平。圖 5顯示，LPS作用于 H7402 細胞后，TNF-α、IL-6、IL-8、VEGF等炎癥相關基因的表達相對于對照組均有所上調，免疫抑制因子TGF-β的表達也有所上調。與對照組相比，上述基因的表達上調倍數分別為1.434、1.322、3.949、2.249 以及 1.506 倍。圖 5 是三次以上平行實驗的統(tǒng)計結果。

圖4 LPS對腫瘤細胞周期、凋亡相關基因的調節(jié)Fig.4 LPS regulated the expression of molecules associated with cell apoptosis and cell cycle

圖5 LPS對腫瘤細胞炎癥相關基因的調節(jié)Fig.5 LPS regulated the expression of genes related to inflammation

圖6 LPS對腫瘤細胞表達淋巴細胞受體配體的調節(jié)Fig.6 LPS regulated the expression of ligands of lymphocyte receptors

2.6 LPS對腫瘤細胞表達淋巴細胞受體配體的調節(jié) 活化性受體NKG2D和凋亡相關分子FasL的活化能夠促進淋巴細胞，如CTL和NK細胞，對腫瘤細胞的殺傷作用。與其相對應的是，腫瘤細胞表面表達的相應受體的配體水平也影響著腫瘤細胞對免疫細胞殺傷的敏感性。我們采用流式細胞術，檢測LPS作用于肝癌細胞H7402 24小時后NKG2D的配體 MICA/B、ULBP2、ULBP4，FasL 的受體 Fas，以及粘附分子CD54的表達水平。我們發(fā)現LPS作用于肝癌細胞 H7402 后 MICA/B、ULBP2、ULBP4、CD54的表達均不受影響，而FasL的受體Fas在LPS作用后其表達顯著下調，由78.44%下調到63.07%，見圖6提示LPS能下調腫瘤細胞Fas的表達，有利于腫瘤細胞逃逸淋巴細胞的監(jiān)視作用。

3 討論

目前已發(fā)現多種 TLRs，其中在人類發(fā)現了TLR1-TLR11，在小鼠中發(fā)現了 TLR1-TLR13[3]。在TLRs中，TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6 和 TLR10表達在細胞膜表面;TLR7、TLR8和TLR9表達在細胞內的內體上;而TLR3在細胞表面及內體都有表達。TLRs能夠識別不同病原微生物高度保守的病原相關分子模式(PAMP)[4，9]，其功能主要表現在活化天然免疫，啟動抗感染免疫應答。例如，巨噬細胞等效應細胞借助TLRs識別PAMP而被激活，繼而分泌炎性因子、介導炎癥反應并發(fā)揮殺菌效應。同時，TLRs也能活化適應性免疫。TLRs與PAMP結合可激活APC，使之表達多種共刺激分子和細胞因子，從而參與T細胞的激活與增殖[4]。

TLRs不僅表達在免疫細胞上，在腫瘤細胞上也有表達，并且對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著重要的作用。一方面，腫瘤細胞上的TLRs被激活后，可以誘導細胞凋亡抑制細胞增殖;另一方面，它也能誘導慢性炎癥的發(fā)生從而促進腫瘤的生長。因此，研究表達在腫瘤細胞上的不同TLRs的功能具有非常重要的意義。

對TLR4的很多研究都是基于TLR4對免疫細胞的作用，證明TLR4活化后能促進樹突狀細胞的成熟，這對于機體是有利的一面，并且已有報道認為表達在炎癥細胞上的TLR4能抑制腫瘤的生長[10]。但是，表達在腫瘤細胞上的TLR4作用卻不盡相同。例如，結腸癌上的TLR4活化能抑制NK細胞和效應性T細胞的活化從而促進結腸癌的發(fā)生發(fā)展[11];在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細胞上的TLR4活化能誘導慢性炎癥[12]。

由于肝臟生理環(huán)境所決定，難以避免與細菌內毒素LPS的接觸。我們的研究表明，TLR4在三種肝癌細胞系中都有表達，TLR4的激動劑LPS對肝癌細胞系有顯著的促增殖作用;同時，LPS處理的腫瘤細胞對化療藥物順鉑的抗腫瘤效應產生明顯的抵抗作用。雖然LPS的受體不僅限于TLR4，TLR2也可以識別 LPS[13]，但是在我們其他的實驗中發(fā)現LPS對于不表達TLR4的腫瘤細胞不具有促進其增殖的作用，說明LPS對消化系統(tǒng)相關腫瘤的刺激作用依賴于TLR4的表達。

進一步研究表明，LPS作用于腫瘤細胞后周期相關的基因CyclinD1表達上調，是引發(fā)LPS促增殖作用的關鍵分子;而凋亡相關分子Bcl-xl表達的上調，使腫瘤細胞抗凋亡的能力增強。另外，我們還發(fā)現LPS能促進肝癌細胞H7402炎性因子(IL-6、IL-8、TNF-α)、VEGF等的表達上調。這些因子不僅能夠促進腫瘤細胞的生長，同樣還能促進髓系誘導的抑制性細胞(MDSC)的生長[14-19]。反過來，MDSC又能誘導慢性炎癥，活化調節(jié)性T細胞而產生免疫抑制作用[20]。同時，腫瘤細胞Fas表達量的下調，有利于腫瘤細胞逃逸CTL或NK細胞的殺傷。

以上研究結果提示，LPS持續(xù)活化TLR4可能是導致肝癌發(fā)展、抵抗化療藥的原因之一。本研究為闡明TLR4在肝癌中的意義和尋找有效的腫瘤的生物治療策略提供了新的實驗依據。

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[收稿2011-11-20 修回2012-03-16]
(編輯 許四平)

The effects of TLR4 activation on the characterizations of hepatocellular carcinoma cell line H7402

ZHANG Yu-Yi，QU Jing，ZHANG Jian.Institute of Immunopharmacology and Immunotherapy，School of Pharmaceutical Sciences，Shandong University，Jinan 250012，China

Objective:To analyze the expression levels of TLR4 expressed on hepatocellular carcinoma cell line H7402，and investigate the effect of LPS on the tumor characterizations，including proliferation ability，inflammatory response and sensitivity to chemotherapy.MethodsThe expression of TLR4，molecules associated with apoptosis and cell cycle on hepatocellular carcinoma cells was detected by RT-PCR.The proliferation of tumor cells was detected by MTT assay.Cell apoptosis was analyzed by AnnexinV/PI assay.The expression of inflammatory factors was determined by quantitative real-time PCR.FACS was used to detect the expression of the molecules expressed on cell surface and CyclinD1.The expression of Bcl-xl was detected by Western blot.ResultsTLR4 was expressed on human hepatocellular carcinoma cell line HepG2，H7402，PLC/PRF/5.LPS could promote the proliferation of hepatocellular carcinoma cells and protect tumor cells from chemotherapy drug.Further investigation indicated that the molecules associated with cell cycle and apoptosis，CyclinD1 and Bcl-xl，were up-regulated，whereas Fas was down-regulated.Additionally，the inflammatory cytokines were also up-regulated by LPS.ConclusionLPS could induce the expression of inflammatory cytokines，promote the proliferation of hepatocellular carcinoma cell H7402 and protect tumor cells from chemotherapy drug.

Hepatocellular carcinoma;TLR4;Cisplatin;Proliferation;Inflammatory cytokines

R735

A

1000-484X(2012)08-0695-06

10.3969/j.issn.1000-484X.2012.08.005

①本文為國家自然科學基金(81172789，30972692)資助項目

張譽藝(1986年-)，女，在讀碩士，主要從事免疫藥理與免疫治療方向的研究，E-mail:yuyi0924@yahoo.com.cn;

及指導教師:張 建(1965年-)，女，博士生導師，主要從事免疫藥理與免疫治療學方面的研究，E-mail:zhangj65@sdu.edu.cn。