孫 靜 傅豐慶 顧文超 申志勇 張學(xué)光 (蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，蘇州215009)

協(xié)同刺激分子B7-H3在脊椎動(dòng)物中的分布及其演化①

孫 靜 傅豐慶②顧文超②申志勇②張學(xué)光②(蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，蘇州215009)

目的:探討B(tài)7-H3分子2種異構(gòu)體在不同物種中的分布及其演化模式以輔助研究B7-H3分子的生物學(xué)功能。方法:通過(guò)生物信息學(xué)方法從各類(lèi)數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索脊椎動(dòng)物各物種的B7-H3分子序列，分析其結(jié)構(gòu)域的數(shù)量及剪切形式預(yù)測(cè)異構(gòu)體的分布;獲取代表性物種的組織抽提RNA，PCR驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果;計(jì)算各物種B7-H3分子中V1C1和V2C2的dN和dS比。結(jié)果:獲取了38個(gè)物種的B7-H3序列，其中豚鼠、家犬、非洲象、牛、熊貓、蝙蝠及高級(jí)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物如黑猩猩、大猩猩、猴等物種中存在2種剪切體;RT-PCR方法證實(shí)了2種剪切體的表達(dá)。各物種V1C1與V2C2序列的非同義突變(dN)大于同義突變(dS)值。結(jié)論:B7-H3分子最早以2IgB7-H3形式存在于硬骨魚(yú)動(dòng)物中，在高級(jí)哺乳動(dòng)物中出現(xiàn)了2種異構(gòu)體;且在自然界壓力選擇下發(fā)生了凈化選擇，并未產(chǎn)生新的生物學(xué)功能。

B7-H3;異構(gòu)體;表達(dá);演化

B7-H3分子是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的B7家族的成員之一，與其它B7家族成員相比，該分子的顯著特點(diǎn)在于:第一:小鼠僅存在一種類(lèi)型B7-H3分子，而人類(lèi)的B7-H3分子有2種不同的剪切體:B7-H3 (2IgB7-H3)和 B7-H3b(4IgB7-H3)[1，2]。第二:該分子的生物學(xué)功能至今尚未明確，正性和負(fù)性作用均有報(bào)道[3-6]。生物學(xué)功能的不明確除和其受體未知相關(guān)外，還可能與其異構(gòu)體的存在有密切關(guān)系，因此回答為何小鼠中僅存在一種亞型而人類(lèi)存在兩種的科學(xué)問(wèn)題以及明確該兩種異構(gòu)體在不同物種中的分布，對(duì)了解該分子的生物學(xué)功能具有重要的意義。

人的B7-H3分子僅由IgV-IgC 2個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域組成，如圖1所示，故又稱(chēng)為2IgB7-H3(B7-H3VC);而B(niǎo)7-H3b分子胞外段由 IgV1-IgC1-IgV2-IgC24個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域組成，因此稱(chēng)為4IgB7-H3(B7-H3VCVC)。基因序列研究發(fā)現(xiàn)4IgB7-H3胞外段4個(gè)結(jié)構(gòu)域是重復(fù)并排的V1C1V2C2，為2IgB7-H3外顯子復(fù)制的結(jié)果[1，2]。本研究擬通過(guò)各物種B7-H3序列分析和序列計(jì)算推導(dǎo)B7-H3分子2種剪切異構(gòu)體的分布形式及基因演化模式以為研究該分子的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

圖1 人B7-H3分子基因結(jié)構(gòu)圖示Fig.1 The gene seructure of human B7-H3 molecule

1 材料與方法

1.1 主要軟件網(wǎng)址和試劑材料

1.1.1 數(shù)據(jù)庫(kù) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/中GENENucleotideProtein數(shù)據(jù)庫(kù);ENSEMBL數(shù)據(jù)庫(kù):http://www.ensembl.org/index.html;基因研究所 http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/tgipage.html;斑馬魚(yú)基因數(shù)據(jù)庫(kù):http://zfin.org/cgi-bin/ webdriver?MIval=aa-ZDB_home.apg。Phylogenetic Analysis by Maximum Likelihood(PAML)軟件用于基因dS/dN值的計(jì)算。

1.1.2 試劑材料 LATaq酶和限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自日本TaKaRa公司;TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;瓊脂粉(日本進(jìn)口分裝)購(gòu)自上海華美公司;小量質(zhì)粒抽提試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司;載體 PMDT-19購(gòu)自 Invitrogen公司;大腸桿菌Top10由本所保種;引物合成和基因測(cè)序送往南京金思特生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 B7-H3分子數(shù)據(jù)的整合、收集 為搜集各物種所有 B7-H3序列，本研究通過(guò)以“B7-H3 OR B7H3 OR CD276”為關(guān)鍵詞搜索多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)如:NCBI的 GENENucleotideProtein和 ENSEMBL，從搜索結(jié)果中提取出現(xiàn)“B7H1 OR B7-H1 OR B7H2 OR B7-H2 OR B7H4 OR B7-H4”O(jiān)R“This record was discontinued”的條目，手工檢驗(yàn)是否存在假陽(yáng)性;以“cd276”為關(guān)鍵詞搜索斑馬魚(yú)基因數(shù)據(jù)庫(kù):http:// zfin.org/cgi-bin/webdriver?MIval=aa-ZDB_ home.apg;以相似性搜索對(duì)鰻魚(yú)可能B7-H3序列進(jìn)行查 找:http://genome.jgi-psf.org/cgi-bin/ runAlignment?db=Brafl1＆advanced=1;通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)之間的交叉索引，得到基因以及蛋白對(duì)應(yīng)的mRNA序列，將所有的mRNA與各自的染色體序列BLAT定位，去除冗余。

1.2.2 B7-H3剪切體分布分析 獲取各物種的B7-H3基因后，分析胞外段結(jié)構(gòu)域數(shù)量及特點(diǎn)，預(yù)測(cè)剪切異構(gòu)體的數(shù)量。

1.2.3 PCR驗(yàn)證生物信息學(xué)結(jié)果 根據(jù)獲取各物種B7-H3序列，進(jìn)行堿基序列比對(duì)從而且設(shè)計(jì)保守

引

物，引物序列如下:上游引物 JBL:GGCAGCTTCACCTGCTTCGTGAG;下游引物JBR:TTGCGCACCAGGCAGCTGTAGGT。TRizol抽提動(dòng)物肝臟RNA，抽提人及猴外周血活化淋巴細(xì)胞RNA。以O(shè)lig dT為引物，總RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈。取cDNA 1 μl為模板，加入B7-H3上下游引物和內(nèi)參引物進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)擴(kuò)增條件為: 94℃，5分鐘;94℃，30 秒;55℃，30 秒;72℃，120 秒(35個(gè)循環(huán));72℃，10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.4 2IgB7-H3 與4IgB7-H3 分子 dN/dS的計(jì)算為觀察B7-H3基因在進(jìn)化過(guò)程中功能的變化，我們通過(guò)PAML軟件計(jì)算其dN/dS的比值。具體操作步驟如下:①調(diào)取各基因的CDS序列，輸入到MEGA4軟件中，翻譯成氨基酸序列后進(jìn)行序列比對(duì)，比對(duì)結(jié)束后再轉(zhuǎn)換成堿基序列，按照Fas格式保存。②將5.1的文件轉(zhuǎn)到 PAML4軟件中BIN文件夾下，用Per1腳本程序?qū)⑵滢D(zhuǎn)成Phylip格式，在文件起始端加上I。③用“test.pl”命令將fas格式轉(zhuǎn)成phy的格式，在MS_DOS界面下運(yùn)行ctl.文件。

2 結(jié)果

圖2 B7-H3同源性引物擴(kuò)增B7-H3基因Fig.2 PCR analysis of different RNA samples using B7-H3-specific primer

表1 各物種B7-H3基因Tab.1 All B7-H3 genes searched from available data

2.1 獲取38個(gè)物種的B7-H3序列 經(jīng)過(guò)對(duì)各類(lèi)數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索比對(duì)，我們獲取了38個(gè)物種的B7-H3基因(如表1所示)，分別為:人、小鼠、大鼠、原雞、黑猩猩、家犬、牛、獼猴、短尾猴、非洲蟾蜍、野豬、珍珠鳥(niǎo)、蜥蜴、狨猴、豚鼠、犰狳、馬、刺猬、貓、三刺魚(yú)、大猩猩、非洲象、袋鼠、狐猴、鴨嘴獸、蹄兔、猩猩、果蝠、松鼠、樹(shù)鼩、青鏘、河豚、海豚、羊駝。2.2 B7-H3基因的表達(dá)模式分析 經(jīng)過(guò)對(duì)各物種B7-H3基因組結(jié)構(gòu)如外顯子的數(shù)量、結(jié)構(gòu)域數(shù)目等分析發(fā)現(xiàn)4IgB7-H3除表達(dá)人組織和細(xì)胞中外，還可表達(dá)于豚鼠、野豬、牛、家犬、非洲象以及猩猩、猴等高級(jí)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中。這些物種4IgB7-H3分子的特性描述見(jiàn)表2。該分子外顯子個(gè)數(shù)為9或10個(gè)，包含4個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域:V1C1V2C2，蛋白質(zhì)氨基酸數(shù)量在530左右。為驗(yàn)證生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的4IgB7-H3表達(dá)模式，我們提取了家犬、豚鼠、牛、羊、小鼠、大鼠以及猴子等物種的肝臟組織或者活化淋巴細(xì)胞細(xì)胞的 RNA，進(jìn)行 RT-PCR。結(jié)果顯示:用B7-H3同源性引物可以從家犬、豚鼠、牛以及猴的cDNA中可以擴(kuò)增得到兩條特異性條帶，一條分子量較大，位于1 000 bp左右，另一條分子量較小，位于300 bp左右(圖2)。經(jīng)過(guò)測(cè)序Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)1 000 bp條帶代表4IgB7-H3的剪切本，300 bp條帶代表2IgB7-H3的剪切本(圖3)。

2.3 基因復(fù)制后的環(huán)境選擇壓力 非同義替換率與同義替換率的比值(dN/dS)是測(cè)驗(yàn)編碼序列所經(jīng)歷的環(huán)境選擇壓力的重要指標(biāo)。若一對(duì)同源序列的dN/dS＜1表示這對(duì)同源序列在基因復(fù)制后經(jīng)歷了純化選擇的作用;若dN/dS≈1表示同源序列在基因復(fù)制之后經(jīng)歷了自然選擇的作用;而dN/dS＞1則表示經(jīng)歷了正選擇作用。為研究B7-H3分子的2種剪切體在物種進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷了何種選擇，是否會(huì)出現(xiàn)新的功能，本研究利用PAML軟件計(jì)算各物種dN/dS的比值，結(jié)果顯示在除各物種B7-H3dN/dS的比值計(jì)算中，分值遠(yuǎn)小于1(表3)。

圖3 犬、牛、猴、豚鼠B7-H3片段測(cè)序結(jié)果Fig.3 The sequencing results of B7-H3 of fragment in dog，cow ，monkey and guinea pigs

表2 各物種4IgB7-H3分子的特性描述Tab.2 Properties of 4IgB7-H3 in some vertebrates

表3 各物種B7-H3 dN/dS的比值Tab.3 The dN/dSratio of B7-H3 in various vertebrates

3 討論

生物信息學(xué)是在數(shù)學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)和生命科學(xué)的基礎(chǔ)上形成的一門(mén)新型交叉學(xué)科，隨著生物技術(shù)和計(jì)算機(jī)技術(shù)的迅猛發(fā)展，生物信息學(xué)已經(jīng)成為目前最為活躍的新型學(xué)科之一。其已越來(lái)越廣泛應(yīng)用于輔助研究生命科學(xué)，為科學(xué)研究提供假設(shè)和推測(cè)，降低研究費(fèi)用、縮短研究周期。

B7-H3分子是新進(jìn)發(fā)現(xiàn)的免疫協(xié)同刺激分子，其在2000年首次從人樹(shù)突細(xì)胞cDNA文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)[7]。B7-H3分子與其它B7家族成員相比，該分子的顯著的特點(diǎn)在于:第一:小鼠中僅存在一種類(lèi)型B7-H3，而人的B7-H3分子有2種不同的剪切體: 2IgB7-H3和4IgB7-H3;第二:該分子的生物學(xué)功能至今尚未明確，正性和負(fù)性作用均有報(bào)道?；虻漠悩?gòu)體在不同物種中的分布表達(dá)可以為生物學(xué)功能的研究提供幫助。多物種完整的基因組序列以及各類(lèi)完善的核苷酸和氨基酸數(shù)據(jù)庫(kù)可以為研究B7-H3異構(gòu)體的分布提供基礎(chǔ)。通過(guò)生物信息學(xué)研究方法我們預(yù)測(cè)4IgB7-H3除在人細(xì)胞和組織表達(dá)外，還可以表達(dá)在豚鼠、野豬、牛、家犬、非洲象以及猩猩、猴等高級(jí)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中，繼而我們通過(guò)分子生物學(xué)研究方法驗(yàn)證了生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的結(jié)果。

功能性蛋白質(zhì)中的大部分氨基酸均處于結(jié)構(gòu)和功能的環(huán)境壓力下:正性選擇對(duì)蛋白質(zhì)的新基序或者新功能的產(chǎn)生起到重要的作用[8]，表現(xiàn)在基因核苷酸序列改變上為非同義突變率大于同義突變(dN/dS＞1);凈化選擇指在自然選擇的環(huán)境壓力下，沒(méi)有帶來(lái)較多的氨基酸改變以產(chǎn)生新的蛋白質(zhì)基序和新的功能。通過(guò)dN/dS計(jì)算我們得出B7-H3分子兩種異構(gòu)體在環(huán)境壓力下沒(méi)有產(chǎn)生正性選擇，即在進(jìn)化史上B7-H3分子未產(chǎn)生功能性分歧。

該部分研究工作對(duì)我們進(jìn)一步明確和研究協(xié)同刺激分子B7-H3的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)，但2種異構(gòu)體之間是否具有功能分歧尚待進(jìn)一步研究。

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4 Sun X，Vale M，Leung E et al.Mouse B7-H3 induces antitumor immunity[J].Gene Ther，2003;10(20):1728-1734.

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[收稿2012-03-20 修回2012-05-16]

(編輯 許四平)

The distribution of B7-H3 in various vertebrate and the evolution of this molecule

SUN Jing，F(xiàn)U Feng-Qing，GU Wen-Chao，SHEN Zhi-Yong，ZHANG Xue-Guang.Suzhou Health Technology College，Suzhou 215001，China

Objective:To discuss the distribution of B7-H3 two isoforms in various invertebrates and its evolution model to help researching the function of B7-H3.MethodsThe various B7-H3 sequences were searched in various databases through bioinformatics methods and analyzed the number of structure domains and the splicing forms to deduce the distribution of B7-H3 in various species.PCR analysis after acquiring the RNA from representative species were performed to verified the prediction.The calculation of ration of dNand dSwere also done.ResultsWe acquired thirty-eight B7-H3 sequences and 4IgB7-H3 was also presented in guniea pigs，dogs，african elephants，panda，bat and higher primate animals，which were verified by PCR analysis.The dNvalule of V1C1and V2C2sequences was greater than dSvalue.ConclusionB7-H3 was earliest expressed in teleost with the form of 2IgB7-H3 and the function of B7-H3 was consistent in evolution.

B7-H3;Isoform;Expression;Evolution

R392.12

A

1000-484X(2012)08-0675-06

10.3969/j.issn.1000-484X.2012.08.001①本文受?chē)?guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31100626)和江蘇省自然科學(xué)基金(BK2011320)的資助

②蘇州大學(xué)生物技術(shù)研究所，蘇州215000

孫 靜(1981年-)，女，講師，主要從事分子免疫與腫瘤免疫學(xué)研究，E-mail:jsun@szhct.edu.cn。