汪 鳳，黃瑞哲，田劍剛，曹峻嶺

(1.西安交通大學口腔醫(yī)院預防科，陜西西安710004; 2.烏魯木齊口腔醫(yī)院兒童牙病科，新疆烏魯木齊830000; 3.西安交通大學醫(yī)學院地方病研究所、教育部環(huán)境與疾病相關(guān)基因重點實驗室，陜西西安710061)

Lumican蛋白聚糖是富含亮氨酸的細胞外蛋白多糖中的一種，這類蛋白多糖與胚胎發(fā)育，組織修復和腫瘤生長過程中的細胞遷移和增殖有關(guān)，并參與組織活動的調(diào)節(jié)，國內(nèi)外學者對它的研究多集中在口腔醫(yī)學以外的領(lǐng)域［1－2］，在牙齒發(fā)育方面未見報道。

Lumican蛋白多糖是一種小的、富含亮氨酸的細胞外基質(zhì)蛋白多糖，能粘結(jié)TGF－β［3］，可以控制細胞的生長、粘附和移行;并能粘附生長因子到細胞外基質(zhì)，從而調(diào)節(jié)生長因子的活性［4］。牙胚發(fā)育的形態(tài)發(fā)生和細胞分化是上皮細胞和間充質(zhì)相互作用的結(jié)果，其調(diào)控的途徑主要有3條:細胞與細胞的直接接觸;細胞外基質(zhì)分子及其受體的相互作用;生長因子等可彌散信號分子的相互作用［5］。從分子水平看，這種相互作用包括著多種信號分子、受體、細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)導途徑以及相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄、表達，形成既相互協(xié)同又相互拮抗的網(wǎng)絡調(diào)節(jié)機制，共同完成牙胚的生長發(fā)育［6］。TGF－β作為上皮－間充質(zhì)細胞的信號調(diào)控分子，對牙胚發(fā)育有重要作用［7－8］，本研究利用動物實驗和免疫組化手段對Lumican蛋白多糖在牙胚中的分布狀況進行觀察，以期初步揭示Lumican蛋白多糖在牙胚發(fā)育過程中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

80 d齡雌性SD大鼠、90 d齡雄性SD大鼠(西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心);兔抗大鼠lumican蛋白多糖一抗(1－C－3)(西安交通大學醫(yī)學院地方病研究所曹峻嶺教授惠贈);即用型SABC (過氧化物酶)試劑盒、DAB顯色試劑盒(博士德生物工程有限公司);旋轉(zhuǎn)式生物組織切片機(YGQ－2，江蘇);光學顯微鏡(OLYMPUS，日本)。

1.2 方法

1.2.1 標本采集和切片

取雌、雄SD大鼠各15只，在發(fā)情期間，以雌∶雄=1∶1的比例在晚8∶00時同籠。次日晨6∶00時取走雄鼠，用生理鹽水充分浸濕的棉簽采集各母鼠的陰道內(nèi)容物并涂于載玻片，用光學顯微鏡在10×15倍下檢查，發(fā)現(xiàn)精子者記為陽性(+)，表明已受孕，并以當日中午定為胚胎發(fā)育的第0.5 d。然后分別取妊娠17.5 d(E17.5組)、妊娠19.5 d (E19.5組)的孕鼠，處死后取出胎鼠并分離出下頜骨;再取出生后1.5 d(P1.5組)、3.5 d(P3.5組)、5.5 d(P5.5組)的新生鼠并分離出下頜骨。分別從上述所有下頜骨中分離出雙側(cè)第一磨牙牙胚，置碘酸鹽－賴氨酸－多聚甲醛固定液中固定后，脫水、石蠟包埋、5 μm切片，多聚賴氨酸包被的玻片撈片，60℃烤片2 h貼片。

1.2.2 HE染色

上述切片常規(guī)HE染色，光學顯微鏡觀察，確定SD大鼠牙胚發(fā)育時期。

1.2.3 SABC法免疫組化染色

切片脫蠟至水(依次浸入二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10 min;梯度乙醇 1 000、950、850、750 mL/L各2 min)，蒸餾水洗;用新鮮配置的30 mL/L的過氧化氫液中，室溫30 min以封閉內(nèi)源性過氧化物酶;蒸餾水洗3次，每次5 min;熱抗原修復，即將切片浸泡于0.01 mol/L的枸櫞酸緩沖液中，電爐上加熱直至沸騰，斷電，靜置10 min，再加熱至沸騰，室溫冷卻，0.02 mol/L的 PBS洗5 min，3次;滴加50 g/L BSA封閉液60 μL封閉，置濕盒內(nèi)，室溫孵育40 min，甩去多余液體，不洗;滴加1∶100比例稀釋的一抗60 μL，在濕盒內(nèi)4℃過夜孵育;從4℃冰箱中取出濕盒，在37℃恒溫箱內(nèi)復溫1 h后取出切片，用0.02 mol/L的PBS洗5 min，3次;滴加生物素化山羊抗兔IgG(二抗)60 μL，濕盒內(nèi)37℃孵育1 h后，0.02 mol/L的PBS洗5 min，3次;滴加即用型SABC，室溫孵育40 min，0.02 mol/L的PBS洗5 min，4次;去離子蒸餾水1 mL加DAB試劑盒中A、B、C試劑各1滴混勻，每張切片滴加60 μL，顯色3～10 min，顯微鏡下控制反應時間，蒸餾水洗;Harris蘇木素輕度復染胞核;脫水透明中性樹膠封片;鏡下觀察并照相。染色中同時設(shè)陰性對照片，滴加PBS代替一抗。

結(jié)果判定標準:①陰性表達(－):組織內(nèi)無淡黃色或棕黃色顆粒，蘇木素復染后呈藍色;②弱陽性表達(±):淡黃色，或陽性著色低于該組織結(jié)構(gòu)的10%;③陽性表達(+):淡黃色或棕黃色顆粒占該組織結(jié)構(gòu)的10%～60%，染色清晰;④強陽性表達(++):淡黃色或棕黃色顆粒占該組織結(jié)構(gòu)的60%以上，染色強。

1.2.4 圖像分析

打開Image－Pro Plus 6.0圖像分析軟件，插入待分析圖片。定義灰度值大的白色為光密度值= 0，灰度值最小的黑色光密度值為無窮大，進行光密度值較正;分別測量累積光密度IOD(Integrated option density)和有效目標分布區(qū)域的面積area，以IOD/area計算平均光密度(Mean density)，取同一實驗組切片各照片的平均值。

1.2.5 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠牙胚發(fā)育過程中Lumican蛋白的時、空表達

2.1.1 E17.5牙胚

第一磨牙牙胚處于帽狀期(增殖期)，分為成釉器、牙乳頭和牙囊3個部分。成釉器分化為3層:外釉上皮層、內(nèi)釉上皮層和星網(wǎng)狀層，牙板與外釉上皮層相連。此時內(nèi)釉上皮、牙乳頭、牙囊呈棕黃色，顏色深度與陽性對照相似;外釉上皮、牙板棕黃色略淺，星網(wǎng)狀層染色深度與背景色相似(圖1a)。

2.1.2 E19.5牙胚

第一磨牙牙胚處于鐘狀早期，成釉器由3層分化為4層，出現(xiàn)了中間層細胞，位于內(nèi)釉上皮層和星網(wǎng)狀層之間，內(nèi)釉上皮為單層細胞排列，在牙尖部呈高柱狀而在牙頸部頸環(huán)處呈矮柱狀。鏡下可見外釉上皮層、內(nèi)釉上皮、牙囊、牙乳頭黃染，顏色深度與陽性對照類似，頸環(huán)處黃染顏色明顯加深，而牙板上皮棕黃色較淺，星網(wǎng)狀層中染色深度與背景色相似(圖1b)。

2.1.3 PN1.5牙胚

第一磨牙牙胚處于鐘狀期(組織分化和形態(tài)分化期)，牙胚部位的成釉細胞已開始分泌少量釉基質(zhì)蛋白。牙乳頭靠近內(nèi)釉上皮的一層分化出現(xiàn)成牙本質(zhì)細胞，呈單層排列，并也已開始分泌少量基質(zhì)。此時成釉細胞黃染，顏色與陽性對照類似;成牙本質(zhì)細胞黃染略淺;而星網(wǎng)狀層、牙髓細胞中染色深度與背景色相似(圖2a)。

2.1.4 PN5.5牙胚

第一磨牙牙胚處于鐘狀末期，已分泌較多釉基質(zhì)蛋白。此時成釉細胞、成牙本質(zhì)細胞黃染程度基本與陽性對照片中的背景色相似，星網(wǎng)狀層、外釉上皮、牙髓細胞中染色深度與背景色相似(圖2b)。

2.1.5 PN9.5牙胚

此時第一磨牙牙胚釉基質(zhì)蛋白分泌基本結(jié)束，但尚未礦化，牙冠基本形成，牙根開始發(fā)育。成釉細胞和成牙本質(zhì)細胞中的染色程度基本與陽性對照片中的背景色相似，牙髓細胞中染色深度與背景色相似(圖2c)。

圖1 胚胎牙胚Lumican蛋白多糖的表達(400×)

圖2 出生后成釉細胞和成牙本質(zhì)細胞中Lumican蛋白多糖的表達(400×)

根據(jù)以上觀察，將各發(fā)育時期牙胚中不同細胞的Lumican蛋白多糖表達情況歸納于表1。

表1 各發(fā)育時期牙胚中不同細胞Lumican蛋白多糖表達情況

2.2 圖像分析結(jié)果

單因素方差分析顯示:總體存在顯著性差異(P＜0.05)，因此可以認為5組Lumican蛋白多糖表達不全相同。進一步組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)，各組間差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(表2)。

表2 Lumican蛋白多糖在各組中表達的光密度值分析結(jié)果

3 討論

牙胚發(fā)育過程中，各類細胞的生長、增殖、分化、凋亡均受到細胞外信號分子的誘導和多種基因的調(diào)控。目前研究認為:牙胚的發(fā)育是上皮－間充質(zhì)相互誘導、相互作用的結(jié)果［9］。轉(zhuǎn)化生長因子β (transformation growth factors，TGF－β)家族是其中主要的信號分子［10］，研究表明:這種細胞因子與細胞膜受體結(jié)合后，在細胞內(nèi)通過信號轉(zhuǎn)導分子將信號傳導至核內(nèi)，調(diào)節(jié)相應的基因表達，促進細胞的分化和各種功能的正常進行［11］。Lumican蛋白多糖是一種小的、富含亮氨酸的細胞外基質(zhì)蛋白多糖，Lumican蛋白多糖能粘結(jié)TGF－β，并通過控制釋放到細胞外基質(zhì)中TGF－β的數(shù)量來調(diào)節(jié)TGF－β的活性。Lumican蛋白多糖可以控制細胞生長、粘附和移行，并能粘附生長因子到細胞外基質(zhì)，從而調(diào)節(jié)生長因子的活性。

在牙胚發(fā)育過程中，內(nèi)釉上皮產(chǎn)生的信號分子作用于牙乳頭細胞，這些信號分子受上皮－間充質(zhì)細胞共同調(diào)控。TGF－β在上皮－間充質(zhì)細胞相互作用起信號分子作用，參與調(diào)控牙胚發(fā)育和細胞分化，而Lumican蛋白多糖可以調(diào)節(jié)TGF－β的活性，因而推斷Lumican蛋白多糖在發(fā)育中呈一定的時空分布可能與調(diào)控TGF－β的活性有關(guān)，在牙胚正常的發(fā)育中起到重要的作用。

在本研究中，E17.5組胎鼠牙胚處于帽狀期，此時成釉器上皮向外胚間充質(zhì)中生長，體積增大，基底部向內(nèi)凹陷，成釉器分化為3層，并形成牙囊包繞成釉器與牙乳頭。免疫組化染色結(jié)果顯示，此時Lumican蛋白多糖主要分布于牙板、成釉器的外釉上皮、內(nèi)釉上皮、牙囊、牙乳頭細胞，而星網(wǎng)狀層細胞中則為陰性表達;E19.5組胎鼠牙胚處于鐘狀早期，內(nèi)釉上皮細胞處于向成釉細胞分化的階段，細胞增殖分化功能活躍，此時外釉上皮層、內(nèi)釉上皮、牙囊細胞、牙乳頭細胞的Lumican蛋白多糖表達呈陽性，而牙板上皮細胞中的表達減弱;PN1.5組牙胚的成釉細胞開始分泌釉基質(zhì)蛋白，分泌功能旺盛，此時成釉細胞中的Lumican蛋白多糖表達呈陽性，同時牙乳頭中分化出的成牙本質(zhì)細胞的胞漿中也有表達。隨著釉基質(zhì)分泌的結(jié)束，成釉細胞分泌功能減退，形態(tài)有所變化，開始進入釉基質(zhì)礦化期，此時可以觀察到PN9.5組中Lumican蛋白多糖在成釉器和牙本質(zhì)細胞中呈弱陽性表達，上述陽性表達區(qū)主要分布在細胞周圍的基質(zhì)中。

本研究中還觀察到自出生0.5 d起，在牙齒發(fā)育的整個過程中，Lumican蛋白多糖在成釉器、牙囊中持續(xù)表達，提示Lumican蛋白多糖參與成釉器的分化和成熟。牙齒發(fā)育過程中，成牙本質(zhì)細胞和牙髓細胞都由起源于外胚層間充質(zhì)的牙乳頭細胞分化而來，二者因為在胚胎發(fā)生和功能上相互關(guān)系密切，因此又稱為牙本質(zhì)－牙髓復合體。成牙本質(zhì)細胞和牙髓細胞都有豐富的合成膠原的能力，而Lumican蛋白多糖在牙乳頭細胞中一直是陽性表達，提示Lumican蛋白多糖也與膠原基質(zhì)(即前期牙本質(zhì))的形成有關(guān)。

Lumican蛋白多糖在發(fā)育中的必須作用，目前尚不明確，有研究表明:Lumican蛋白多糖可以結(jié)合TGF－β，而TGF－β與牙胚發(fā)育有關(guān)，從而提示Lumican蛋白多糖在大鼠牙胚的發(fā)育過程中的作用，可能與介導TGF－β等生長因子有關(guān)。Lumican蛋白多糖作為一種重要的細胞外基質(zhì)蛋白，與機體多種器官的發(fā)育密切相關(guān)。本研究觀察Lumican蛋白多糖在牙胚的發(fā)育過程中的時空表達，表明其在牙胚的發(fā)育中主要起著調(diào)節(jié)和介導作用，而Lumican蛋白多糖在牙胚發(fā)育過程中更詳細的機制還有待于進一步實驗證明。

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