古艷婷，趙婷婷，李 平，張浩軍，朱 斌，韓文兵，董 晞，費(fèi) 敏，孫斯凡

（1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，北京 100021；2.衛(wèi)生部中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所，北京 100029）

糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今仍未完全闡明。許多研究認(rèn)為糖尿病腎病時存在著自噬活性的下調(diào)，自噬途徑受到抑制可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器或蛋白大量積聚，足細(xì)胞完整性受到破壞、腎小管上皮細(xì)胞損傷及腎肥大等病理進(jìn)程，參與了DN的發(fā)生發(fā)展［1］，而自噬激活對腎損傷有保護(hù)作用并可維持足細(xì)胞完整性。課題組在前期差異蛋白質(zhì)組學(xué)中發(fā)現(xiàn)，二氫生物喋呤還原酶（dihydropteridine reductase，QDPR）在自發(fā)性II型糖尿病模型OLETF大鼠腎臟損害時的氨基酸發(fā)生突變，但該基因產(chǎn)物是否參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展還未有報道。本研究構(gòu)建了野生型和突變型的QDPR重組質(zhì)粒初步探討了二氫生物喋呤還原酶對自噬作用的影響，以期為深入研究其在糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

HEK 293T細(xì)胞、綠色熒光蛋白（GFP）為中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所藥物藥理室保存；真核表達(dá)載體pcDNA3.1/V5-His（美國Invitrogen公司）；新型pUM-T快速克隆試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司）；高保真PCR擴(kuò)增試劑盒（德國Roche公司），T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶EcoR V、Pst I、Xba I（美國NewEngland Biolabs公司）；限制性內(nèi)切酶Xba I、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（加拿大Fermentas公司）；凝膠回收純化試劑盒、質(zhì)粒中提試劑盒（德國QIAGEN公司）；DNA Maker DM5000（北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司）；鼠單抗V5抗體（美國Invitrogen公司）；兔多抗LC3（美國Sigma公司），兔多抗Beclin1抗體（美國Sigma-Aldrich公司），山羊抗小鼠IgG抗體（美國Abcam公司）；羊抗兔IgG抗體（美國Abcam公司）；Western Lightening ECL（美國Perkin Elmer公司）；胎牛血清（美國GIBCO公司）；高糖DMEM培養(yǎng)基干粉（美國GICBO-BRL公司）。

1.2 野生型和突變型QDPR重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1.2.1 引物設(shè)計與RT-PCR擴(kuò)增 根據(jù) G eneBank中大鼠QDPR mRNA序列設(shè)計引物，上游引物引入EcoR V酶切位點，下游引物引入 X ba I酶切位點，由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。引物序列如下：上游5＇-AGATATCTGGCGGCTTCGGGCGAGGC-3＇；下游5＇-ATCTAGAGAAATAGGCTGGAGTAAGCT-3＇，分別以正常LETO大鼠與OLETF糖尿病大鼠腎臟皮質(zhì)cDNA為模板，采用高保真PCR試劑盒擴(kuò)增正常QDPR以及突變QDPR cDNA片段，PCR反應(yīng)體系（50μL）中上、下游引物各1μL，cDNA 2μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2 m in；94℃變性30 s；54℃退火30 s；72℃延伸1 m in；共循環(huán)32次后72℃延伸10 m in。對PCR產(chǎn)物用1.2％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，之后進(jìn)行回收純化，-20℃保存。

1.2.2 pUM-T克隆 PCR產(chǎn)物回收純化后克隆至pUM-T載體，轉(zhuǎn)化到 D H5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性單克隆進(jìn)行酶切鑒定及測序。

1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 用EcoR V、Xba I雙酶切QDPR/pUM-T獲得QDPR目的片段；用EcoR V、Xba I雙酶切 p cDNA3.1/V5-His作為載體。用 T 4DNA連接酶連接目的片段與載體，構(gòu)建野生型 r QDPR/ pcDNA3.1/V5-His重組質(zhì)粒（rQDPRwt）和突變型rQDPR/pcDNA3.1/V5-His重組質(zhì)粒（rQDPRmut）。

1.3 HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組

HEK 293T細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于轉(zhuǎn)染前24 h傳代，以2x106/孔的細(xì)胞密度接種于 1 0 cm培養(yǎng)皿中，在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁后利用磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染，共轉(zhuǎn)染3次。實驗分組：野生型重組質(zhì)粒組（rQDPRw t組），突變型重組質(zhì)粒組（rQDPRmut組），pcDNA3.1/V5-His載 體組（control vector組）。綠色熒光蛋白（GFP）作為轉(zhuǎn)染效率的參照物，轉(zhuǎn)染72 h后倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。

1.4 RT-PCR檢測LC3，Beclin1轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)

轉(zhuǎn)染72 h后收集細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞總RNA。取2μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按Fermentas cDNA反轉(zhuǎn)錄試盒的步驟進(jìn)行。PCR采用立陶宛MBl公司試劑盒PCR反應(yīng)擴(kuò)增，以CyclophilinB作為內(nèi)參照。各引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系（12.5μL）中上、下游引物各0.5μL，cDNA 2μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s；退火30 s（LC3為52℃，Beclin1為56℃）；72℃延伸45 s；共循環(huán)35次后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠上電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察條帶，以目的條帶吸光度值與CyclophilinB吸光度值比值作為目的產(chǎn)物的半定量值，Image J軟件進(jìn)行分析。

表1 PCR引物序列及產(chǎn)物長度Tab.1 The primer sequences and the length of products

1.5 WesternBlot檢測測LC3I，II，Beclin1蛋白水平表達(dá)

轉(zhuǎn)染72 h后收集細(xì)胞，吸棄培養(yǎng)液，PBS輕洗，加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，冰浴10 min后移至離心管，超聲離心，分光光度計進(jìn)行蛋白定量。分別取60μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳并電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5 g/L脫脂奶粉封閉2 h，TBST洗膜，用鼠單抗V5抗體（1∶5000），LC3抗體（1：2000），Beclin1抗體（1∶2000）及抗β-actin抗體（1∶2000），4℃過夜。山羊抗鼠IgG（1∶10000），山羊抗兔IgG （1∶3000）孵育1 h，TBST洗膜3次后ECL化學(xué)發(fā)光顯色后顯影。ImageJ軟件進(jìn)行分析吸光度（A）值，并計算LC3I，II和Beclin1的A值與β-actin A值的比值，分析各組LC3 I，II和Beclin1蛋白的相對表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)資料用（±SD）

表示，采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。組間差異采用One-way ANOVA，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果

重組質(zhì)粒構(gòu)建后經(jīng)酶切鑒定，結(jié)果顯示酶切條帶與預(yù)期一致，野生型重組質(zhì)粒測序結(jié)果與GeneBank BLAST比較后證實為QDPR cDNA序列，突變型重組質(zhì)粒測序結(jié)果也顯示突變位置正確，說明野生型和突變型重組質(zhì)粒構(gòu)建成功（數(shù)據(jù)未顯示）。

2.2 WesternBlot檢測融合蛋白水平表達(dá)

轉(zhuǎn)染72 h后收集細(xì)胞蛋白，用鼠單抗V5抗體檢測到rQDPRwt組和rQDPRmut組融合蛋白的表達(dá)，對照組未見目的蛋白表達(dá)，見圖1。結(jié)果表明野生型和突變型重組質(zhì)粒能夠在HEK 293T細(xì)胞中正確表達(dá)。

2.3 QDPR高表達(dá)以及QDPR突變高表達(dá)后對LC3，Beclin1mRNA水平的影響

圖1 Western blot檢測轉(zhuǎn)染后融合蛋白表達(dá)Fig.1 The detection of fusion protein after transfection

野生型QDPR重組質(zhì)粒和突變型QDPR重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞72 h后，RT-PCR檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，rQDPRwt組LC3 mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.05），Beclin1表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)意義，rQDPRmut組與對照組相比LC3和Beclin1表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（圖2，3）。

2.4 QDPR高表達(dá)以及QDPR突變高表達(dá)后對LC3，Beclin1蛋白水平的影響

圖2 QDPR對LC3和Beclin1 mRNA表達(dá)的影響Fig.2 The effect of QDPR on the mRNAlevel of LC3 and Beclin1

圖3 QDPR對LC3和Beclin1 mRNA表達(dá)影響的半定量分析（*P＜0.05 vs.control）Fig.3 The semiquantitative analysis of QDPR on the mRNA level of LC3 and Beclin1（*P＜0.05 vs.control）

野生型QDPR重組質(zhì)粒和突變型QDPR重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞72 h后，Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，rQDPRwt組LC3和Beclin1蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)（P＜0.05），rQDPRmut組LC3和Beclin1表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（圖4，5）。

圖4 QDPR對LC3和Beclin1蛋白表達(dá)的影響Fig.4 The effect of QDPR on proteinlevel of LC3 and Beclin1

3 討論

二氫生物喋呤還原酶蛋白以二聚體形式在動物體內(nèi)廣泛分布［2］，該酶在四氫生物喋呤（tetrahydrobiopterin，BH4）再生過程中起到重要作用，其主要功能是催化醌型二氫生物喋呤（quinonoid dihydrobiopterin，qBH2）還原成BH4，對維持體內(nèi)BH4含量穩(wěn)定有著重要意義［3］。BH4生理功能廣泛，而這些生理功能和DN的發(fā)生關(guān)系密切。BH4是3種一氧化氮合酶（nitric oxide syhthase，NOS）激活所必需的輔助因子，而NOS是體內(nèi)NO產(chǎn)量的主要來源［4］。有研究表明NO和自噬有密切關(guān)系［5］。課題組在前期差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，與正常LETO大鼠相比，自發(fā)性II型糖尿病模型OLETF大鼠QDPR基因發(fā)生突變，但該基因是否參與糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展有待進(jìn)一步研究。

圖5 QDPR對LC3和Beclin1蛋白表達(dá)影響的半定量分析（*P＜0.05 vs.control，＊＊P＜0.01 vs.control）Fig.5 The semiquantitative analysis of QDPR on proteinlevel of LC3 and Beclin1（*P＜0.05 vs.control，＊＊P＜0.01 vs.control）

自噬是細(xì)胞通過溶酶體對自身結(jié)構(gòu)的吞噬降解過程，主要是清除、降解細(xì)胞內(nèi)受損傷的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、不需要的生物大分子以及衰老的細(xì)胞器等，同時也為細(xì)胞器的構(gòu)建提供原料［6］。然而，過度的自噬也會引起細(xì)胞的損傷或死亡。因此，自噬對細(xì)胞的作用具有兩面性［7］。近年來有研究顯示在STZ誘導(dǎo)的1型DN大鼠腎組織自噬標(biāo)志分子LC3-2明顯降低，糖尿病腎病存在著自噬活性的下調(diào)，而自噬激活在腎損傷中可能發(fā)揮著細(xì)胞保護(hù)作用［8］。自噬作用可通過Western blotting檢測自噬蛋白LC3和的Beclin-1表達(dá)量等方法來反映。LC3前體（proLC3）在蛋白水解酶的作用下剪切C末端形成LC3I，最后經(jīng)泛素樣加工修飾過程成為與磷脂酰乙醇胺（PE）結(jié)合的LC3II，能靶向定位于自噬體膜，參與自噬的形成［9］。目前認(rèn)為LC3II是自噬體的標(biāo)志分子，是代表自噬作用的主要指標(biāo)。Beclin-l基因是哺乳動物最早發(fā)現(xiàn)的一個自噬基因，其表達(dá)強(qiáng)度與自噬活性密切相關(guān)［10］。本研究通過構(gòu)建QDPR野生型和突變型重組質(zhì)粒，觀察了QDPR對HEK293T細(xì)胞自噬作用的影響，結(jié)果顯示野生型QDPR重組質(zhì)粒組LC3II水平和Beclin-l水平顯著高于對照組和突變組，提示QDPR可能誘導(dǎo)自噬活性或者使發(fā)生自噬的潛能增加，當(dāng)其93位氨基酸突變后對自噬的這一調(diào)控作用下降。由此我們推測QDPR可能和糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，并且課題組發(fā)現(xiàn)的QDPR突變位點可能是其調(diào)控自噬作用的關(guān)鍵位點。但是它是如何調(diào)控自噬并參與疾病的具體分子機(jī)制還不清楚，有可能是通過影響NO的生成和氧化應(yīng)激的一些變化或某些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制來完成，但在疾病中究竟發(fā)揮了何種作用，目前仍在探索，也是我們下一步研究的方向。

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