徐 露，董 志（重慶醫(yī)科大學(xué)重慶市生化與分子藥理重點實驗室，重慶 400016）

注射用羥基紅花黃色素A對大鼠腦神經(jīng)元線粒體的保護作用研究

徐 露＊，董 志（重慶醫(yī)科大學(xué)重慶市生化與分子藥理重點實驗室，重慶 400016）

目的：研究注射用羥基紅花黃色素A對大鼠腦神經(jīng)元線粒體的保護作用。方法：采用線栓法復(fù)制大鼠腦缺血再灌注模型，實驗分為假手術(shù)（等容生理鹽水）、模型（等容生理鹽水）、尼莫地平（1.0mg·kg－1）和羥基紅花黃色素A高、中、低劑量（10.24、5.12、2.56mg·kg－1）組。尾iv給藥，每天1次，連續(xù)3 d。測定大鼠血清中血小板活化因子（PAF）含量、腦海馬組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和Mg2+-ATP酶活性；觀察電鏡下灰質(zhì)部位神經(jīng)元線粒體超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果：與模型組比較，羥基紅花黃色素A高、中、低劑量組大鼠血清中PAF的含量顯著降低，海馬組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和Mg2+-ATP酶含量顯著提高（P＜0.01）；神經(jīng)元線粒體結(jié)構(gòu)較完整，線粒體的破壞明顯比模型組輕。結(jié)論：注射用羥基紅花黃色素A具有明顯的腦線粒體保護作用。

羥基紅花黃色素A；線粒體；血小板活化因子

紅花是我國傳統(tǒng)的活血化瘀良藥，主要有效成分是羥基紅花黃色素A（Hydroxysafflor yellow A，HSYA），其不僅是一種藥物，也是一種食品和染料。羥基紅花黃色素A只能通過靜脈給藥，在臨床上治療各種缺血性心腦血管疾病，效果良好，但作用機制不甚明確。本文擬將注射用羥基紅花黃色素A的神經(jīng)保護作用機制做一個初步分析，旨在為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Hitachi-7500透射電鏡（日本日立公司）；722型分光光度計（中國科技研究院）。

1.2 試藥

注射用羥基紅花黃色素A（浙江永寧藥業(yè)股份有限公司，批號：20100305，含量：每瓶含量為85%）；尼莫地平注射液（天津藥業(yè)集團新鄭股份有限公司，批號：20100118）；三磷酸腺苷（ATP）酶試劑盒（南京建成生物工程研究所）；血小板活化因子（PAF）Elisa試劑盒（武漢中美科技有限公司，批號：20100319）。

1.3 動物

清潔級SD大鼠，♀♂兼用，體重200～250 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供（動物使用合格證號：SCXK（渝）20020001）。

2 方法

2.1 復(fù)制模型

采用線栓法復(fù)制大腦中動脈閉塞（MCAO）模型。10%水合氯醛，按1m L·100 g－1ip麻醉大鼠。頸部正中切口，分離右頸總動脈與頸內(nèi)、頸外動脈。在距頸動脈分叉5mm處，雙線結(jié)扎頸外動脈，頸內(nèi)動脈穿線備用，結(jié)扎右頸總動脈的近心端。在靠近動脈分叉的頸總動脈壁上剪一小口，插入一直徑為0.2mm的尼龍線（尼龍線頭端用石蠟薄薄地包裹），經(jīng)頸內(nèi)動脈進(jìn)入大腦中動脈起始部，以阻斷大腦中動脈的血流。插入線長約16mm時，有明顯阻力感。結(jié)扎頸內(nèi)動脈與尼龍線，防止插線脫落。假手術(shù)組除不插入尼龍線外其他手術(shù)步驟同手術(shù)組。缺血30m in后，緩慢拔出栓子約10mm，剪斷線栓外露部分，扎緊活結(jié)，使血流恢復(fù)成再灌注狀態(tài)。

2.2 分組與給藥

將60只大鼠隨機分為6組，即假手術(shù)（等容量生理鹽水）、模型（等容量生理鹽水）、尼莫地平（1.0mg·kg－1）和羥基紅花黃色素A高、中、低劑量（10.24、5.12、2.56mg·kg－1）組。各組均于缺血再灌注后2 h尾iv給藥，每天1次，連續(xù)3 d。

2.3 PAF含量檢測

手術(shù)前大鼠頸動脈取血0.5m L，最后一次給藥后12 h，大鼠眼眶取血0.5m L，室溫放置1 h后取血清，嚴(yán)格按照試劑盒步驟檢測PAF含量水平。

2.4 ATP酶含量檢測

將海馬組織制成10%的勻漿，2 000 r·m in－1離心10m in，取上清液，1 000 r·min－1離心15min，沉淀物即為線粒體。用Low ry法進(jìn)行蛋白定量，經(jīng)檢測證實制備的線粒體純度較高。將分離的線粒體用冰冷的勻漿介質(zhì)制成混懸液，超聲波粉碎法破碎線粒體，測定Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和Mg2+-ATP酶含量。

2.5 電鏡樣品的制備

將各組大鼠用4%的戊二醛心臟灌流固定，快速取出缺血側(cè)大腦皮層，切成1mm3小塊，置于4%的戊二醛電鏡液中固定，按照電鏡樣品制備程序漂洗、脫水、浸透與環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片后，將切片撈至銅網(wǎng)上，干燥后進(jìn)行鉛鈾雙染。透射電鏡下觀察網(wǎng)孔中細(xì)胞形態(tài)及其超微結(jié)構(gòu)的改變并攝片。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 PAF含量檢測結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中PAF含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，羥基紅花黃色素A高、中、低劑量組大鼠血清中PAF含量顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）。PAF含量檢測結(jié)果見表1。

表1 PAF含量檢測結(jié)果（±s，n＝10）Tab 1 Resultsof content determ ination of PAF（±s，n＝10）

表1 PAF含量檢測結(jié)果（±s，n＝10）Tab 1 Resultsof content determ ination of PAF（±s，n＝10）

與假手術(shù)組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.sham operation group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

給藥后0.59±0.05 2.36±0.28＊1.66±0.85# 1.17±0.33## 1.35±0.24## 1.41±0.39## n組別假手術(shù)組模型組尼莫地平組羥基紅花黃色素A高劑量組羥基紅花黃色素A中劑量組羥基紅花黃色素A低劑量組10 10 10 10 10 10 PAF含量/ng·mL－1給藥前0.64±0.07 0.55±0.04 0.72±0.10 0.60±0.09 0.74±0.15 0.68±0.12

3.2 ATP酶活力比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬線粒體的Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和Mg2+-ATP酶活性顯著減弱（P＜0.01）；與模型組比較，羥基紅花黃色素A高、中、低劑量組大鼠海馬線粒體的Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和Mg2+-ATP酶活性顯著增強（P＜0.01）。ATP酶活力檢測結(jié)果見表2。

表2 ATP酶活力檢測結(jié)果（±s，n＝10）Tab 2 Resultsof theactivity of ATPenzyme（±s，n＝10）

表2 ATP酶活力檢測結(jié)果（±s，n＝10）Tab 2 Resultsof theactivity of ATPenzyme（±s，n＝10）

與假手術(shù)組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.01vs.sham operation group：＊P＜0.01；vs.modelgroup：#P＜0.01

組別假手術(shù)組模型組尼莫地平組羥基紅花黃色素A高劑量組羥基紅花黃色素A中劑量組羥基紅花黃色素A低劑量組Mg2+-ATP酶/μmol·mg-1 3.74±0.15 2.54±0.07＊3.30±0.18# 3.53±0.14# 3.38±0.13# 3.29±0.16# n 10 10 10 10 10 10 Na+-K+-ATP酶/μmol·mg-1 3.88±0.17 2.67±0.09＊3.16±0.13# 3.55±0.18# 3.62±0.16# 3.40±0.15# Ca2+-ATP酶/μmol·mg-1 2.57±0.08 1.23±0.05＊1.89±0.06# 2.24±0.10# 2.05±0.09# 2.16±0.12#

3.3 電鏡觀察結(jié)果

假手術(shù)組可見正常的桿狀線粒體，橢圓形，結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)均勻，分布有序，嵴豐富；模型組可見神經(jīng)元壞死，線粒體數(shù)量減少，明顯腫脹、空泡化，嵴排列不規(guī)則甚至斷裂；羥基紅花黃色素A高、中、低劑量組線粒體損傷較模型組明顯減輕，線粒體結(jié)構(gòu)較為清晰，腫脹或變形較不明顯，基質(zhì)中無空泡，內(nèi)膜較為完整。電鏡觀察結(jié)果見圖1。

4 討論

PAF是一種炎癥因子，許多炎性細(xì)胞如肥大細(xì)胞、堿性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞與血小板等均可合成和釋放PAF。目前，國內(nèi)、外已經(jīng)有大量文獻(xiàn)報道，在各種缺血性心腦血管疾病、哮喘、潰瘍等患者當(dāng)中，血清PAF含量較正常人有顯著升高，尤其在疾病發(fā)生的急性期，PAF含量升高最快。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，高、中、低劑量注射用羥基紅花黃色素A均能降低MCAO模型大鼠手術(shù)后血清PAF含量，提示其具有一定的抗炎作用[1，2]。

圖1 電鏡觀察結(jié)果（20 000×）A.假手術(shù)組；B.模型組；C.尼莫地平組；D.羥基紅花黃色素A高劑量組；E.羥基紅花黃色素A中劑量組；F.羥基紅花黃色素A低劑量組Fig 1 resultsof electronm icroscope（20 000×）A.sham operation group；B.model group；C.nimodipine group；D. HSYA high-dose group；E.HSYA medium-dose group；F.HSYA low-dosegroup

ATP酶存在于組織細(xì)胞與細(xì)胞器膜上，是生物膜上的蛋白酶，在物質(zhì)運輸、能量轉(zhuǎn)換以及信息傳遞方面具有重要作用。機體在缺氧與一些疾病狀態(tài)下，此酶活力會發(fā)生一系列改變，膜上各種離子泵（Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和Mg2+-ATP酶）的泵功能失調(diào)，細(xì)胞內(nèi)、外離子失衡，造成細(xì)胞內(nèi)Na+、Ca2+大量聚集，細(xì)胞水腫，甚至死亡。注射用羥基紅花黃色素A能夠顯著提高海馬區(qū)域的線粒體ATP酶含量，改善線粒體ATP酶活性，保障能量代謝的順利進(jìn)行，從而減輕神經(jīng)元的損傷。從線粒體的超微結(jié)構(gòu)上來看，羥基紅花黃色素A可改善MCAO模型大鼠腦組織線粒體的超微結(jié)構(gòu)，可能與線粒體ATP酶活性的提高從而更好地維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)有關(guān)[3，4]。

綜上所述，注射用羥基紅花黃色素A能夠有效減少MCAO模型大鼠的炎癥因子PAF含量水平，減輕炎癥，提高線粒體ATP酶活性，維持正常的線粒體結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到神經(jīng)保護效果。

[1] Jiang X，ShiE，Nakajima Y，etal.Posteonditioning，aseries of brief intem iptions of early reperfusion，prevents neurologic injury after spinal cord ischem ia[J].Ann Surg，2006，244（1）：145.

[2] Blecharz-Klin K，Piechal A，Joniec I，et al.Pharmacological and biochem ical effects ofGinkgo bilobaextract on learning，memory consolidation and motor activity in old rats[J].Acta Neurobiol Exp（Wars），2009，69（2）：217.

[3] Nishida Y，Ito S，OhtsukiS，etal.Depletion of vitamin E increases abeta accumulation by decreasing its clearances from brain and blood in amousemodel of A lzheimer disease[J].JBiolChem，2009，284（48）：33 400.

[4] 趙淑敏，劉 勝，楊宏光，等.黃芩葉總黃酮預(yù)處理對缺血再灌注心肌脂質(zhì)過氧化損傷的保護作用[J].解剖學(xué)雜志，2006，29（4）：450.

Protective Effect of HSYA Freeze-dried Powder on Brain Neuronal M itochondria of Rats

XU Lu，DONG Zhi（Chongqing Key Laboratory of Biochem istry and Molecular Pharmacology，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

OBJECTIVE：To study the protective effect of HSYA freeze-dried powder on brain neuronalmitochondria of rats. METHODS：Cerebral ischemia-reperfusion modelwas induced by suturemethod.Model rats were divided into 5 groups，i.e.sham operation group（constant volume normal saline），model group（constant volume normal saline），nimodipine group（1.0mg·kg－1），HSYA high-dose，medium-dose and low-dose groups（10.24 mg·kg－1，5.12 mg·kg－1，2.56 mg·kg－1）.They were given relevant drugs intravenously via tail once a day for consecutive 3 days.The content of PAF in serum and the activity of Na+-K+-ATP enzyme，Ca2+-ATP enzyme and Mg2+-ATP enzyeme in hippocampus were all determined.We observed ultrastructure of mitochondrial in gray area w ith electron m icroscope.RESULTS：Compared w ith model group，the content of PAF in serum of HSYA high-dose，medium-dose and low-dose groups could decrease significantly，and the activity of Na+-K+-ATP enzyme，Ca2+-ATP enzyme and Mg2+-ATP enzyme in hippocampus could increase significantly（P＜0.01）.M itochondrial structure wasmore complete and mitochondrial damaging in HSYA groups was slighter than that in model group.CONCLUSION：HSYA freeze-dried powder has a significant protective effect on brain m itochondria.

HSYA；M itochondria；PAF

R285.5；R97

A

1001-0408（2012）23-2127-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2012.23.06

＊助理研究員，碩士。研究方向：新藥研發(fā)。E-mail：xulu62@163. com

2011-06-19

2011-10-28）