及時(shí)檢測(cè)孢子蟲寄生挽救蜂群

近年來，我們這些從事蜜蜂工作的人，在養(yǎng)蜂實(shí)踐上經(jīng)歷了重要的變化，保持蜜蜂健康似乎將蜂群常規(guī)管理轉(zhuǎn)變成蜂群生存斗爭(zhēng)。一些問題可以用新疾病或產(chǎn)生抗藥性的微生物加以說明。在蜂巢內(nèi)外增加應(yīng)用合成的殺蟲劑沒有幫助，不同殺蟲劑的混合（即便單獨(dú)應(yīng)用時(shí)它們對(duì)蜜蜂沒有劇毒）能夠影響蜜蜂的健康和免疫反應(yīng)，產(chǎn)生不可預(yù)料的結(jié)果，使蜂群容易感染各種疾病。

由于正在受到喪失重要授粉者的威脅，美國國會(huì)批準(zhǔn)增加蜜蜂研究經(jīng)費(fèi)，發(fā)現(xiàn)蜂群下降的原因?？茖W(xué)家正在尋找蜂群衰竭失調(diào)（CCD）綜合征的根本原因，探索新疾病、有害化合物或危害蜂群的各種因素，以便使蜂群恢復(fù)健康。許多這樣的緊迫問題將安排在美國農(nóng)業(yè)部新的研究協(xié)作計(jì)劃（CAP），系統(tǒng)地分析從定地蜂場(chǎng)采集的蜜蜂、花粉和蜂蠟。

被鑒定的可疑點(diǎn)如此之多，蜜蜂病毒和微孢子蟲已經(jīng)引起特別的關(guān)注。它們大部分是細(xì)胞內(nèi)寄生，肉眼檢查蜂群不能檢測(cè)到。蜜蜂最終表現(xiàn)出疾病癥狀時(shí)，大部分蜜蜂被感染以致死亡，大多數(shù)情況下挽救蜂群已經(jīng)太晚了。

至少在上世紀(jì)50年代，在美國就已經(jīng)有蜜蜂微孢子蟲，但是它出現(xiàn)在蜜蜂上是個(gè)混淆的問題。發(fā)現(xiàn)在蜂箱前爬行的染病蜂遺留下下痢的黃色帶（糞便），通常使用抗生素治療。為什么現(xiàn)在科學(xué)家對(duì)近年發(fā)生的蜂群損失懷疑微孢子蟲？有的甚至指出蜜蜂微孢子蟲是蜂群衰竭失調(diào)的主要原因。顯然，微孢子蟲的一個(gè)新種，東方蜜蜂微孢子蟲（Nosema ceranae）現(xiàn)在廣泛分布在美國及全世界，悄悄地取代著蜜蜂微孢子蟲（Nosema apis）。在1966年幾乎沒有被發(fā)現(xiàn)，但是在2005年觀察到亞洲蜜蜂遭受這種疾病時(shí)重新引起關(guān)注。2006年，在歐洲檢測(cè)到東方蜜蜂微孢子蟲，使西班牙、法國、德國及瑞士的蜂群遭受到嚴(yán)重?fù)p失。因?yàn)檫@個(gè)新種在蜂場(chǎng)不容易檢測(cè)，在不知不覺感染了好長(zhǎng)時(shí)間。蜜蜂可能感染了幾個(gè)星期不顯示臨床癥狀。這兩種微孢子蟲孢子在顯微鏡下觀察非常相似，顯微鏡鑒定這個(gè)新種也是挑戰(zhàn)。為了鑒定，蜜蜂樣本通常送到能進(jìn)行脫氧核糖核酸擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)室，科學(xué)家采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）確定這兩種微孢子蟲的基因不同。感染東方蜜蜂微孢子蟲的蜂群死亡非常迅速，蜂群生存取決于及時(shí)的檢測(cè)和治療。然而，等待實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果喪失了寶貴的時(shí)間。因此，開發(fā)快速簡(jiǎn)單的檢測(cè)工具，能夠挽救整個(gè)蜂場(chǎng)，預(yù)防疾病的流行。

一、纖維素試紙測(cè)定

這種想法并不新鮮，是根據(jù)免疫學(xué)原理（抗體蛋白的相互作用）研制的。它們時(shí)常被設(shè)計(jì)成纖維素試紙的形式，以便在野外和家庭中使用。雖然，基于抗體的纖維素試紙測(cè)定是通過研發(fā)制成復(fù)雜的技術(shù)，實(shí)際的產(chǎn)品裝備成一個(gè)試劑盒，使用方便。這種方法是在醫(yī)學(xué)上應(yīng)用，最熟悉的是人的妊娠試驗(yàn)。

為了使這種技術(shù)適應(yīng)養(yǎng)蜂業(yè)的需要，將要開發(fā)一種簡(jiǎn)單無誤的方法，檢測(cè)蜜蜂樣本中的微孢子蟲感染。這項(xiàng)研究作為CAP的一部分正在美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究中心的蜜蜂研究室（HBRU）執(zhí)行，將與私人生物技術(shù)公司合作。

二、試劑盒工作原理

試劑盒含有多條纖維素試紙，每一條使用一次。將壓碎的蜜蜂或從多只蜜蜂解剖出來的中腸放入有試劑的玻璃瓶中，把一條纖維素插入勻漿里。過一會(huì)將出現(xiàn)一條或兩條色帶。如果只看到一條藍(lán)色帶（對(duì)照），見圖1-1A（-）指示為陰性結(jié)果。如果看到兩條帶，指示為陽性結(jié)果，一條藍(lán)色帶為對(duì)照，另一條紅色帶指示目標(biāo)微孢子蟲蛋白質(zhì)，見圖1-1A（+）。

東方蜜蜂微孢子蟲抗體（Ab）結(jié)合到纖維素條帶上，作為一個(gè)“紅旗”和一個(gè)為免疫原（微孢子蟲蛋白質(zhì)）的固位槽。免疫反應(yīng)是微孢子蟲抗體和微孢子蟲蛋白質(zhì)之間的非常強(qiáng)的結(jié)合（圖1-1B）。微孢子蟲孢子加入反應(yīng)混合物中時(shí)，微孢子蟲抗體將與微孢子蟲蛋白質(zhì)結(jié)合，形成非常牢固的帶。如果這種反應(yīng)采用第二抗體（抗體檢測(cè)者）與顏色檢測(cè)兩者結(jié)合，則出現(xiàn)兩條顏色帶（對(duì)照和具體的微孢子蟲）指示有微孢子蟲孢子。顯示一條顏色帶（對(duì)照）指示陰性結(jié)果。

這種檢測(cè)法的基本思想不是新的，從前許多人想開發(fā)這種測(cè)定方法。然而，主要的困難是，抗體質(zhì)量不佳，缺乏特異性，敏感性差，阻礙成功地開發(fā)出一種快速的測(cè)試方法。抗體通常是通過將一種外來的蛋白質(zhì)（免疫原）注射到山羊、兔子或老鼠等動(dòng)物體內(nèi)。動(dòng)物的免疫系統(tǒng)檢測(cè)到外來蛋白質(zhì)的入侵，反應(yīng)產(chǎn)生抗體。很明顯，抗體的質(zhì)量左右免疫試樣的成敗?？贵w檢測(cè)的好壞要看原來的免疫原的型式和純度而定。

在實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)免疫原時(shí)，時(shí)間、努力和它的合成物需要的資源是巨大的。制造純凈的免疫原是個(gè)挑戰(zhàn)。污染的分子可成為第二免疫原，結(jié)果抗體缺乏特異性。我們決定選擇一種新方法，所謂的基因抗體技術(shù)（GAT）（圖2）來避免這種錯(cuò)誤。采用這種技術(shù)完全是關(guān)于免疫原的新思路。采用基因抗體技術(shù)，是將含有目標(biāo)（在我們的例子是微孢子蟲）脫氧核糖核酸序列編碼蛋白質(zhì)的一段環(huán)形的脫氧核糖核酸（質(zhì)粒）注入動(dòng)物，然后在動(dòng)物體內(nèi)（通過動(dòng)物）直接產(chǎn)生純的蛋白質(zhì)，從而避免在實(shí)驗(yàn)室正常長(zhǎng)度蛋白質(zhì)的生產(chǎn)過程。在活體內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)被動(dòng)物視為外來的入侵者，轉(zhuǎn)而觸發(fā)產(chǎn)生抗體并釋放到動(dòng)物血液中。

采用基因抗體技術(shù)的一個(gè)困難是首先需要知道蛋白質(zhì)順序。這有一系列阻礙，除非病原的基因組已經(jīng)測(cè)序。很幸運(yùn)，美國農(nóng)業(yè)部正在給兩種微孢子蟲測(cè)序。我們將能夠測(cè)定位于東方蜜蜂微孢子蟲孢子壁的目標(biāo)蛋白質(zhì)的順序（美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究中心貝爾茨維里蜜蜂研究室Dr.Jay Evans提供DAN順序）。現(xiàn)在正在對(duì)蜜蜂樣本測(cè)試新的東方蜜蜂微孢子蟲抗體。至今我們的測(cè)試顯示很高的抗體敏感性，在稀釋1∶5000的粗蜜蜂勻漿能檢測(cè)微孢子蟲孢子，與商業(yè)生產(chǎn)的抗體（的靈敏度）相似。這種方法也能檢測(cè)低量的孢子。采用常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室凝膠方法，確定新抗體能在1000只無感染的蜜蜂中檢測(cè)出1只感染蜜蜂。這種水平的敏感度能夠在蜂群中檢測(cè)非常低的感染率。

三、試劑盒的應(yīng)用

這種測(cè)驗(yàn)不是要取代實(shí)驗(yàn)室通用的方法。不需要取代為處理大量樣本設(shè)計(jì)的高生產(chǎn)率技術(shù)。它會(huì)幫助養(yǎng)蜂人、養(yǎng)蜂愛好者以及商業(yè)養(yǎng)蜂者在野外檢測(cè)和監(jiān)視疾病的進(jìn)程。它能幫助養(yǎng)蜂人關(guān)于處理疾病做出理智的決定。最重要的是，這種新檢測(cè)工具優(yōu)點(diǎn)有：（1）能夠減少不必要的治療，降低抗生素的使用；（2）為管理者在處理國內(nèi)外蜜蜂移動(dòng)方面有一個(gè)新的做出決定的工具；（3）蜂王和籠蜂生產(chǎn)者可檢測(cè)和監(jiān)視他們的生產(chǎn)群微孢子蟲水平。

黃文誠 譯自《美國蜜蜂》雜志2010第1期