翟文亮 鄭燕梅 丁真奇 呂辰瑋 高躍川 郭以河

(中國(guó)人民解放軍第175醫(yī)院 廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院骨科，漳州 363000)

富血小板血漿復(fù)合物對(duì)腱－骨愈合界面力學(xué)性能影響的組織學(xué)研究*

翟文亮 鄭燕梅①丁真奇 呂辰瑋①高躍川①郭以河

(中國(guó)人民解放軍第175醫(yī)院 廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院骨科，漳州 363000)

目的 通過(guò)對(duì)健康成年新西蘭大白兔行生物力學(xué)拉伸試驗(yàn)后標(biāo)本的腱骨界面、移植物及其斷裂層面進(jìn)行組織學(xué)及組織化學(xué)觀察，評(píng)價(jià)富血小板血漿(platelet rich plasma，PRP)復(fù)合異體脫蛋白骨(deproteined bone，DPB)對(duì)前交叉韌帶(anterior cruciate ligament，ACL)重建后腱骨愈合的影響。 方法 36只成年新西蘭大白兔，隨機(jī)分為3組，每組12只:富血小板血漿復(fù)合異體脫蛋白骨組(PRP+DPB組)，異體脫蛋白骨組(DPB組)，空白對(duì)照組。建立雙側(cè)自體單股半腱肌肌腱重建ACL模型，前2組骨隧道內(nèi)分別植入PRP凝膠與DPB復(fù)合物、DPB，空白對(duì)照組行單純ACL重建。術(shù)后4、8、12、24周取材行生物力學(xué)測(cè)試(單一軸向的拉伸試驗(yàn))后，采用HE、Alcian blue、Masson染色及VEGF免疫組織化學(xué)觀察各組腱骨愈合、移植物及其斷裂層面組織學(xué)特點(diǎn)，分析各自的力學(xué)薄弱點(diǎn)。 結(jié)果 行拉伸試驗(yàn)后，術(shù)后4、8周各組標(biāo)本肌腱移植物均從股骨隧道內(nèi)斷裂拉出，但PRP+DPB組術(shù)后8周時(shí)標(biāo)本肌腱斷裂處靠近股骨隧道內(nèi)口，DPB組及空白對(duì)照組斷裂部位位于隧道中段。術(shù)后12周時(shí)PRP+DPB組6個(gè)標(biāo)本中有5個(gè)肌腱斷裂部位在關(guān)節(jié)腔內(nèi)部分，另2組仍從隧道內(nèi)斷裂拉出。術(shù)后24周時(shí)各組標(biāo)本均在關(guān)節(jié)腔內(nèi)部分?jǐn)嗔?。組織學(xué)觀察:術(shù)后4周時(shí)PRP+DPB組HE染色見(jiàn)斷裂層面在腱骨結(jié)合部，可見(jiàn)少許疏松的纖維組織，Alcian blue染色未見(jiàn)細(xì)胞異染，Masson染色見(jiàn)肌腱斷端纖維排列紊亂，VEGF免疫組化染色見(jiàn)較多陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá);DPB組及空白對(duì)照組斷裂層面在腱骨界面，斷端見(jiàn)瘢痕組織。術(shù)后8周時(shí)PRP+DPB組HE染色見(jiàn)斷裂層面在隧道內(nèi)口處腱骨結(jié)合部，可見(jiàn)較致密的纖維結(jié)締組織，Alcian blue染色未見(jiàn)細(xì)胞異染，Masson染色見(jiàn)肌腱斷端纖維排列較前規(guī)則，VEGF免疫組化染色仍有較多陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，但較之前少;DPB組及空白對(duì)照組在靠近隧道中段處腱骨界面斷裂，斷端見(jiàn)疏松纖維組織。術(shù)后12周時(shí)PRP+DPB組肌腱斷端見(jiàn)膠原纖維排列較前有序，梭形細(xì)胞散在分布，Alcian blue染色見(jiàn)斷端有少量細(xì)胞異染，VEGF免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量少;DPB組及空白對(duì)照組在靠近隧道內(nèi)口處腱骨界面斷裂，斷端見(jiàn)較致密的纖維組織，肌腱斷端纖維排列紊亂，Alcian blue染色未見(jiàn)異染。術(shù)后24周時(shí)各組斷端纖維排列整齊，PRP+DPB組可見(jiàn)橢圓形細(xì)胞，Alcian blue染色呈異染，較另2組明顯，VEGF免疫組化3組均難以檢出。術(shù)后4、8、12周，PRP+DPB組VEGF表達(dá)與DPB組、空白對(duì)照組有顯著性差異(P＜0.05)，即表達(dá)增強(qiáng);DPB組與空白對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)VEGF表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);術(shù)后24周3組標(biāo)本的VEGF表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 結(jié)論 ACL重建術(shù)后早期(8周以內(nèi))的薄弱點(diǎn)在腱骨界面，晚期在于移植肌腱。PRP可以提高腱骨間骨向肌腱內(nèi)長(zhǎng)入，從而增加腱骨愈合后的抗拉伸力。

腱－骨愈合; 富血小板血漿; 前交叉韌帶; 重建; 組織學(xué)

*南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)科技創(chuàng)新課題基金資助項(xiàng)目(09MA070)

①(福建中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生，福州 350000)

前交叉韌帶(anterior cruciate ligament，ACL)是膝關(guān)節(jié)內(nèi)重要的靜力性穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，損傷后難以自愈。目前，手術(shù)重建ACL是治療ACL斷裂的有效方法，重建后腱－骨愈合與否是手術(shù)成敗的關(guān)鍵因素。本研究在行單股半腱肌重建ACL時(shí)于骨隧道中分別加入富血小板血漿(platelet rich plasma，PRP)復(fù)合異體脫蛋白骨(deproteined bone，DPB)復(fù)合物(PRP+DPB)、DPB，并與空白對(duì)照組相比較，術(shù)后不同時(shí)間對(duì)移植物拉伸后進(jìn)行組織學(xué)、組織化學(xué)觀察，旨在觀察腱骨界面、移植物及其斷裂層面組織學(xué)情況，在形態(tài)學(xué)上找出腱骨愈合的薄弱點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康成年新西蘭大白兔36只［清潔級(jí)，由廈門大學(xué)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物批號(hào):SYXK(閩)，2007－0013，雌雄不限］，體重3 ～3.5 kg，隨機(jī)分為3 組，每組12只:富血小板血漿復(fù)合異體脫蛋白骨組(PRP+DPB組，于骨隧道中加入PRP及DPB復(fù)合物);異體脫蛋白骨組(DPB組，于骨隧道中植入DPB);空白對(duì)照組(僅行雙股半腱肌移植重建ACL，骨隧道內(nèi)不植入任何物質(zhì))。市售新鮮新生小牛股骨干骺端松質(zhì)骨。牛凝血酶(1000 U/支，凍干粉劑)、氯化鈣凝結(jié)劑(Sigma公司，美國(guó));血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF(武漢博士德公司)，枸椽酸鈉抗凝劑(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)試劑公司);電子顯微鏡(Olympus公司，日本)。

1.2 PRP、DBP及其凝膠復(fù)合物的制備

1.2.1 PRP 制備 參照改進(jìn)的 Landesberg 等［1］的方法制備PRP:自兔耳背中央動(dòng)脈采集5 ml全血，采用二次離心法制備PRP。先將裝有5 m l全血的A離心管放入恒溫離心機(jī)內(nèi)，以轉(zhuǎn)速1400 r/min離心10 min，離心后吸取上部血漿及界面下2 mm的紅細(xì)胞轉(zhuǎn)移至B離心管中，B離心管再次以轉(zhuǎn)速140O r/min離心15 min，去掉上部的血漿層，剩余約l.2 ml搖勻即為PRP。全部過(guò)程均在無(wú)菌條件下進(jìn)行，離心機(jī)內(nèi)的溫度恒定22℃，并保持環(huán)境溫度于20℃。

1.2.2 DPB制備 根據(jù)丁真奇等［2］方法進(jìn)行DPB制備。洗凈、烘干、分袋、環(huán)氧乙烷消毒，備用。

1.2.3 PRP/DPB復(fù)合物的制備 將異種脫蛋白松質(zhì)骨與富血小板血漿在抽真空條件下混合，使富血小板血漿被吸附入異種脫蛋白骨的纖維孔隙中，完成兩者的復(fù)合。在復(fù)合過(guò)程中加入0.2 ml凝血?jiǎng)?由10%氯化鈣1 ml與1000 U的牛凝血酶組成)，搖勻，放置10 s左右使其封閉部分纖維孔隙，減少PRP的快速滲出。

1.3 手術(shù)方法及術(shù)后處理

速眠新Ⅱ注射液和氯胺酮注射液等量混合，按0.4 ml/kg于肌內(nèi)注射行全身麻醉。雙膝備皮，術(shù)區(qū)消毒，鋪巾，屈膝90°。按趙耀等［3］報(bào)道的方法重建兔ACL，將肌腱牢固縫合于股骨外側(cè)隧道口周圍軟組織上，進(jìn)行懸吊式固定。DPB+PRP組及DPB組分別將PRP復(fù)合物或DPB通過(guò)股骨及脛骨隧道內(nèi)外口填入股骨及脛骨隧道內(nèi);空白對(duì)照組:不放置肌腱以外的植入材料。術(shù)后查前抽屜試驗(yàn)及Lachman試驗(yàn)陰性后，徹底沖洗關(guān)節(jié)，關(guān)閉關(guān)節(jié)腔，逐層縫合。術(shù)后每只兔分籠喂養(yǎng)，術(shù)后3 d青霉素注射液800 000 U/d肌注預(yù)防感染。

1.4 移植物的拉伸

分別于術(shù)后4、8、12、24周用空氣栓塞法處死，每組各時(shí)間點(diǎn)各處死3只。剔除多余軟組織，制成骨－前交叉韌帶－骨標(biāo)本。取材時(shí)主要大體觀察骨隧道封閉情況、肌腱移植物是否斷裂移動(dòng)等，并做記錄。用牙托粉包埋好標(biāo)本的脛骨端和股骨端，測(cè)試在BiominMTS858萬(wàn)能測(cè)試材料機(jī)上進(jìn)行。行單一軸向的拉伸試驗(yàn)，拉伸速度500 mm/min，分別記錄移植肌腱斷裂的部位。

1.5 組織學(xué)分析

將生物力學(xué)測(cè)試后的標(biāo)本置于10%中性福爾馬林固定，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋，沿骨隧道縱軸面切片，制成6μm厚的切片。分別行 HE、Alcian blue、Masson染色及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)免疫組織化學(xué)染色。VEGF的檢測(cè)使用即用型免疫組織化學(xué)染色試劑盒(鼠抗兔，武漢博士德公司)，步驟按說(shuō)明書進(jìn)行，鏡下觀察VEGF的表達(dá)情況。采用FPAXMedview1.0圖像分析系統(tǒng)對(duì)每張切片于高倍視野(×400)下隨機(jī)選取10個(gè)不重疊視野進(jìn)行半定量測(cè)定VEGF免疫組織化學(xué)染色積分吸光度值(IA)，細(xì)胞質(zhì)或間質(zhì)出現(xiàn)棕褐色均染或顆粒判為VEGF陽(yáng)性細(xì)胞。每個(gè)標(biāo)本取2張切片，計(jì)算平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大體形態(tài)觀察及斷裂部位

重建ACL大致呈柱狀，較正常ACL暗淡，脛骨止點(diǎn)端均較股骨止點(diǎn)處粗大，移植物表面覆蓋有滑膜及少量血管。PRP+DPB組各時(shí)間點(diǎn)標(biāo)本見(jiàn)有類軟骨樣組織封閉隧道內(nèi)口(圖1a)，且晚期較早期多。DPB組肌腱移植物較PRP+DPB組細(xì)，骨隧道稍有擴(kuò)大(圖1b)?？瞻讓?duì)照組肌腱更細(xì)，有少量標(biāo)本移植物呈絲狀自溶現(xiàn)象，骨隧道明顯擴(kuò)大(圖1c)。生物力學(xué)拉伸試驗(yàn)后，4、8周時(shí)各組標(biāo)本肌腱移植物均從股骨隧道內(nèi)斷裂拉出，但PRP+DPB組術(shù)后8周時(shí)標(biāo)本肌腱斷裂處靠近股骨隧道內(nèi)口，DPB組及空白對(duì)照組斷裂部位位于隧道中段。術(shù)后12周時(shí)PRP+DPB組肌腱斷裂部位為關(guān)節(jié)腔內(nèi)部分，而其他2組仍從隧道內(nèi)斷裂拉出。術(shù)后24周時(shí)各組標(biāo)本均在關(guān)節(jié)腔內(nèi)部分?jǐn)嗔选?/p>

2.2 組織學(xué)觀察和比較

2.2.1 HE染色 術(shù)后4周PRP+DPB組肌腱斷裂部位位于股骨隧道內(nèi)，斷裂層面在腱骨結(jié)合部，可見(jiàn)少許疏松的纖維組織。DPB組移植物斷裂部位及層面觀察與PRP+DPB組相似?？瞻讓?duì)照組肌腱與骨隧道間隙較大，斷裂部位靠近股骨隧道外口，斷裂層面處見(jiàn)疤痕組織。術(shù)后8周PRP+DPB組移植肌腱與骨隧道間可見(jiàn)纖維軟骨帶連接，近隧道外口及隧道中段見(jiàn)軟骨細(xì)胞逐漸鈣化成骨，有少許新生骨組織向肌腱內(nèi)長(zhǎng)入，肌腱纖維內(nèi)見(jiàn)梭形細(xì)胞，纖維排列較前有序，斷裂部位靠近隧道內(nèi)口，斷裂層未見(jiàn)新生骨;DPB組及空白對(duì)照組均形成sharpey’s纖維，纖維走向不規(guī)則，結(jié)合疏松，斷裂部位近隧道中段。術(shù)后12周PRP+DPB組腱骨界面處見(jiàn)典型的四層結(jié)構(gòu)及潮線，新生骨明顯成熟，隧道內(nèi)部分肌腱纖維排列有序，移植物于關(guān)節(jié)腔內(nèi)部位斷裂，斷端見(jiàn)膠原纖維排列較隧道內(nèi)紊亂，梭形細(xì)胞及橢圓形細(xì)胞較少(圖2a);DPB組及空白對(duì)照組sharpey’s樣纖維較前有序，肌腱纖維不規(guī)整，斷裂部位位于隧道內(nèi)口，斷端可見(jiàn)少量軟骨細(xì)胞(圖2b，c)。24周3組移植肌腱均從關(guān)節(jié)腔部位斷裂，但PRP+DPB組腱骨界面編織骨已成熟，向肌腱方向長(zhǎng)合，肌腱纖維排列較另2組有序，肌腱中央部位可見(jiàn)散布的軟骨細(xì)胞，而另兩組被纖維結(jié)締組織連接。

2.2.2 Alcian blue染色 術(shù)后4周時(shí)在腱骨界面，PRP+DPB組較DPB組及空白對(duì)照組見(jiàn)較多短桿狀或橢圓形細(xì)胞，Alcian blue染色時(shí)細(xì)胞周圍有異染，而在肌腱部位及斷層則無(wú)此異染現(xiàn)象。術(shù)后8周時(shí)PRP+DPB組腱骨結(jié)合部及肌腱內(nèi)均見(jiàn)軟骨細(xì)胞，異染明顯，斷層未見(jiàn)異染(圖3a);DPB組較空白對(duì)照組亦見(jiàn)有軟骨細(xì)胞，但二者肌腱內(nèi)及斷層未見(jiàn)異染現(xiàn)象(圖3b，c)。術(shù)后12周時(shí)PRP+DPB組隧道內(nèi)腱骨界面及肌腱內(nèi)中央部位見(jiàn)成串狀的軟骨細(xì)胞，有些軟骨細(xì)胞鈣化，形成骨組織，肌腱斷端少許軟骨細(xì)胞分布。術(shù)后24周時(shí)3組腱骨界面、移植肌腱及斷層可見(jiàn)軟骨細(xì)胞異染，但PRP+DPB組較另2組明顯。

圖1 a.術(shù)后4周PRP+DPB組，隧道口有類軟骨樣組織封閉;b.術(shù)后4周DPB組，股骨隧道口擴(kuò)大;c.術(shù)后4周空白對(duì)照組，股骨隧道口明顯擴(kuò)大 圖2 a.術(shù)后12周PRP+DPB組，斷裂部位在關(guān)節(jié)腔內(nèi)部分，但隧道內(nèi)移植物部分撕裂，腱骨界面結(jié)合緊密;b.術(shù)后12周DPB組，斷裂部位在隧道內(nèi)口，斷端膠原纖維排列尚整齊，腱骨界面結(jié)合較PRP+DPB組疏松;c.術(shù)后12周空白對(duì)照組斷裂部位在隧道內(nèi)，斷端膠原纖維排列紊亂，腱骨界面結(jié)合仍較前2組疏松 HE染色 ×100 圖3 a.術(shù)后8周PRP+DPB組，隧道內(nèi)腱骨結(jié)合緊密，新生骨向肌腱內(nèi)長(zhǎng)入，見(jiàn)較多橢圓形細(xì)胞，周圍異染;b.術(shù)后8周DPB組，斷裂部位在隧道內(nèi)口，腱骨界面未見(jiàn)新生骨向肌腱長(zhǎng)入，但亦見(jiàn)異染的軟骨細(xì)胞;c.術(shù)后8周空白對(duì)照，肌腱撕裂部位未見(jiàn)骨組織長(zhǎng)入 Alcian blue染色 ×100 圖4 a.術(shù)后12周PRP+DPB組，隧道內(nèi)腱骨結(jié)合緊密，腱骨界面見(jiàn)典型的四層結(jié)構(gòu)，潮線形成，肌腱纖維走向整齊;b.術(shù)后12周DPB組，腱骨界面結(jié)合較疏松，肌腱纖維走向規(guī)則;c.術(shù)后12周空白對(duì)照，肌腱纖維走向較紊亂，肌腱呈縱向波浪狀，結(jié)合疏松 M asson染色 ×100 圖5 a.術(shù)后8周，PRP+DPB組VEGF的陽(yáng)性表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性;b.術(shù)后8周，DPB組VEGF的陽(yáng)性表達(dá)呈弱陽(yáng)性，與PRP+DPB組相比明顯較少;c.術(shù)后8周，空白對(duì)照組VEGF的陽(yáng)性表達(dá)與PRP+DPB組相比明顯較少，但與DPB組相比無(wú)明顯差異

2.2.3 Masson染色 術(shù)后4周時(shí)PRP+DPB組肌腱與骨隧道間形成較致密的纖維樣結(jié)締組織，肌腱纖維走向紊亂;DPB組及空白對(duì)照組形成的纖維樣組織較疏松，肌腱纖維走向更加紊亂。術(shù)后8周時(shí)PRP+DPB組肌腱纖維走向較前有序規(guī)則，見(jiàn)長(zhǎng)梭形細(xì)胞及橢圓狀細(xì)胞;DPB組纖維走向較空白對(duì)照組有序，肌腱內(nèi)少許橢圓狀細(xì)胞。術(shù)后12周時(shí)PRP+DPB組隧道內(nèi)部位纖維組織排列規(guī)則(圖4a)，但關(guān)節(jié)腔部位肌腱纖維仍較紊亂，長(zhǎng)梭形細(xì)胞及橢圓形細(xì)胞較隧道內(nèi)部位少;另2組較8周時(shí)纖維排列規(guī)則，且DPB組纖維走向較空白對(duì)照組整齊(圖4b，c)。術(shù)后24周時(shí)PRP+DPB組纖維排列近似正常的 ACL，肌腱中央部位軟骨細(xì)胞排列，而DPB組及空白對(duì)照組纖維排列縱向成波狀，未見(jiàn)明顯的軟骨細(xì)胞形成。

2.2.4 VEGF免疫組織化學(xué) 術(shù)后4周的標(biāo)本中，3組均見(jiàn)明顯的VEGF表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞，但PRP+DPB組每高倍鏡視野下陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯高于DPB組及空白對(duì)照組。術(shù)后8周及12周時(shí)在腱－骨界面，PRP+DPB組VEGF表達(dá)趨于下降，僅局限于成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，但仍多于DPB組及空白對(duì)照組，DPB組與空白對(duì)照組相似(圖5)。術(shù)后24周時(shí)各組VEGF表達(dá)均難以檢出。

2.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 術(shù)后 4周，PRP+DPB組VEGF表達(dá)與DPB組、空白對(duì)照組有顯著性差異(P ＜0.05)，即表達(dá)增強(qiáng);術(shù)后 8、12 周，PRP+DPB組VEGF表達(dá)與DPB組、空白對(duì)照組有顯著性差異(P＜0.05);DPB組與空白對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)VEGF表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);術(shù)后24周3組標(biāo)本的VEGF表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表1。

表1 3組標(biāo)本不同時(shí)間點(diǎn)VEGF的表達(dá)(n=6)

3 討論

3.1 PRP可以促使腱－骨界面直接止點(diǎn)的形成

ACL重建后移植肌腱與骨隧道及早、可靠的愈合是手術(shù)成功的關(guān)鍵。正常的ACL通過(guò)膠原纖維與礦化組織相連，這種連接是一種逐漸過(guò)渡的組織結(jié)構(gòu)，可以分為4個(gè)區(qū)域:韌帶、纖維軟骨、礦化的纖維軟骨和骨［4］。研究表明ACL重建后可形成直接止點(diǎn)或間接止點(diǎn)［5］。間接的sharpey’s纖維連接和直接的纖維軟骨連接為腱－骨界面提供了不同的固定強(qiáng)度和界面屬性。近年來(lái)的研究普遍認(rèn)為:腱－骨愈合時(shí)，首先形成一圈富含血管的纖維結(jié)締組織帶(界面組織)填充在腱與骨之間［6］，隨后來(lái)源于隧道骨組織的成纖維細(xì)胞逐漸長(zhǎng)入，形成連接，繼而形成類似直接止點(diǎn)的結(jié)構(gòu)。本研究結(jié)果顯示PRP+DPB組各時(shí)間點(diǎn)腱骨界面均較另外2組成熟，8周時(shí)可見(jiàn)較規(guī)則的sharpey’s纖維，12周時(shí)即見(jiàn)典型的四層結(jié)構(gòu)，形成直接止點(diǎn)，并可見(jiàn)編織骨形成，新生骨組織向肌腱內(nèi)長(zhǎng)合，結(jié)合緊密，說(shuō)明PRP有利于ACL重建后腱－骨界面形成直接止點(diǎn)。

3.2 隧道內(nèi)肌腱的韌帶化重建

ACL重建術(shù)后腱－骨的良好愈合不僅包括腱骨止點(diǎn)的形成，也包括肌腱移植物的韌帶化過(guò)程。ACL重建后，肌腱移植物早期出現(xiàn)急性炎癥反應(yīng)，組織缺血壞死;隨后進(jìn)入慢性炎癥階段，移植物再血管化，細(xì)胞再生增殖;最后膠原纖維爬行替代、塑型及韌帶化［7］。再血管化對(duì)移植物愈合非常重要，但再血管化通常需要較長(zhǎng)時(shí)間。Unterhauser等［8］報(bào)道移植肌腱在術(shù)后6周時(shí)血管密度最高，術(shù)后24周時(shí)達(dá)到正常ACL水平。本實(shí)驗(yàn)中PRP+DPB組VEGF的陽(yáng)性表達(dá)在早期較DPB組及空白對(duì)照組高，晚期無(wú)差異。8周時(shí)肌腱中央部位Alcian blue染色有明顯異染現(xiàn)象，說(shuō)明這些細(xì)胞分泌酸性黏多糖蛋白，為軟骨細(xì)胞，移植肌腱已逐步韌帶化，近似正常的ACL?？瞻讓?duì)照組各時(shí)間點(diǎn)無(wú)明顯異染，肌腱纖維呈縱向波狀，肌腱韌帶化較差，形態(tài)學(xué)仍近似于半腱肌腱。實(shí)驗(yàn)說(shuō)明PRP復(fù)合物有助于重建后肌腱的韌帶化重建，進(jìn)而更好地促進(jìn)腱骨愈合。

3.3 腱－骨界面新骨形成與斷裂部位的關(guān)系

重建ACL的最終目的是要達(dá)到功能上的恢復(fù)。在狗的模型中，Rodeo等［9］證明移植肌腱在骨隧道的愈合要16周。在拔出實(shí)驗(yàn)時(shí)，斷裂發(fā)生在移植物本身或者加固部位，然而在2、4、8周時(shí)斷裂發(fā)生在固定部位，12周時(shí)可能出現(xiàn)混合型的斷裂。本研究結(jié)果表明各時(shí)間點(diǎn)各組行生物力學(xué)拉伸試驗(yàn)后的斷裂部位及層面組織學(xué)結(jié)構(gòu)有差異。術(shù)后4周時(shí)各組均為隧道內(nèi)斷裂拉出，但PRP+DPB組靠近隧道中段，其他2組靠近隧道外口;術(shù)后8周時(shí)PRP+DPB組靠近隧道內(nèi)口，另2組靠近隧道中段;術(shù)后12周時(shí)PRP+DPB組斷裂位于肌腱關(guān)節(jié)腔內(nèi)部位，而DPB組及空白對(duì)照組仍在隧道內(nèi)部位。這些說(shuō)明隧道內(nèi)存在不同的生物學(xué)及生物力學(xué)環(huán)境，隧道內(nèi)腱骨愈合情況受固定后雨刷效應(yīng)、橡皮筋效應(yīng)、關(guān)節(jié)液等影響。PRP+DPB組各時(shí)間點(diǎn)斷裂部位與其他2組不同，斷裂面有較多軟骨細(xì)胞形成，可見(jiàn)新生骨組織向肌腱內(nèi)長(zhǎng)合，長(zhǎng)合的部位未見(jiàn)斷裂，斷裂主要發(fā)生在未長(zhǎng)合的部位，而其他組缺乏這種骨組織的長(zhǎng)入。說(shuō)明PRP確有促進(jìn)成骨作用，進(jìn)而促進(jìn)腱骨愈合，而骨組織的長(zhǎng)入可顯著提高界面愈合后的抗拉伸力。

3.4 PRP增強(qiáng)腱－骨間結(jié)合力的可能機(jī)制

腱－骨愈合的修復(fù)是多種生長(zhǎng)因子共同作用的結(jié)果，腱－骨愈合進(jìn)程中多種生長(zhǎng)因子在腱骨界面表達(dá)［10，11］。PRP 富含多種生長(zhǎng)因子，PRP 與 DPB 凝膠復(fù)合物既具有高效誘導(dǎo)成骨活性和骨傳導(dǎo)作用，又不引起免疫排斥反應(yīng)，其主要成分PRP經(jīng)凝血酶－鈣劑激活后釋放大量高濃度生長(zhǎng)因子［12～14］，具有促進(jìn)組織愈合和組織再生的功能［15］，并且來(lái)源于自體，采集方便，安全價(jià)廉，具有廣泛的應(yīng)用前景。但PRP促進(jìn)腱骨愈合的機(jī)制尚未明了，PRP+DPB組標(biāo)本隧道口處有類軟骨樣組織填充，這可能是PRP促進(jìn)成骨，封閉隧道口，阻止關(guān)節(jié)液浸入隧道內(nèi)，從而促進(jìn)腱骨愈合。PRP與DPB復(fù)合在腱骨結(jié)合部塞入，消除了腱骨間的縫隙，使肌腱與骨隧道直徑匹配合理，擠壓嚴(yán)密，這也有利于避免鐘擺效應(yīng)，防止骨隧道擴(kuò)大，從而避免關(guān)節(jié)液浸入骨隧道而影響腱骨愈合。此外，本研究結(jié)果顯示肌腱與骨整合部位結(jié)合緊密，未發(fā)生斷裂，斷裂層面主要發(fā)生在組織學(xué)上兩者未長(zhǎng)合處，說(shuō)明提高腱骨間骨向肌腱長(zhǎng)入可能是促進(jìn)腱骨愈合的有力措施。由于目前上PRP促進(jìn)腱骨愈合的研究還尚處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究階段，應(yīng)用于臨床仍需要長(zhǎng)期的努力與探索。

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(責(zé)任編輯:李賀瓊)

Effect of Platelet-rich Plasma on the M echanical Property of Healing Tendon-bone Interface:Histological Study

Zhai Wenliang*，ZhengYanmei，DingZhenqi*，etal.*DepartmentofOrthopedics，175thHospitalofChinesePLA，Zhangzhou363000，China

ObjectiveTo observe the histological changes at the tendon-bone interface，graft and ruptured locations after tensile fracture test of the anterior cruciate ligament reconstruction，and to evaluate effectof platelet-rich plasma(PRP)combined with deproteinized bone(DPB)of the calf as a bone tunnel infilling on the healing tendon-bone interface.MethodsA total of 36 healthy，skeletally ature New Zealand white rabbits were random ly divided into PRP+DPB，DPB，and control groups，with 12 rabbits in each.An ACL reconstructionmodelwas established with semitendinosus tendon autograft.In the PRP+DPB and DPB groups，PRP and/or DPB were placed into the bone tunnel.Atweek 4，8，12，and 24，specimenswere obtained for tensile fracture test，and then HE，Alcian blue，Masson，and VEGF immunohistochemistry staining were used to observe the tendon-bone healing，graft，and the rupture locations.ResultsAfter the tensile fracture test，the tendon graftswere ruptured and pulled out from the femoral tunnel in all the groups atweeks4 and 8;however in the PRP+DPB group，the rupturewas close to the inner end of the femoral tunnel atweek 8，while in the DPB and control groups，it was located in themiddle of the tunnel.At week 12，five of the six specimens from the PRP-DPB group showed the rupture site in the articular cavity，while in the other groups，itwas still in the femoral tunnels.Atweek 24，in all the groups，the rupturewas located in the articular cavity.Atweek 4，the rupture in the PRP+DPB group was shown at the tendon-bone interface，and a little loose fibrous tissuewere detected with HE staining at4 weeks;irregular collagen fiberswere seen in the stump with Masson staining and VEGF.In the other two groups，the rupturewas also at the tendon-bone interface，and scar tissues were discovered there.At week 8，the rupture in the PRP+DPB group was at the tendon-bone interface，but closer to the cavumarticulare;there were dense fibrillar connective tissues shown with HE staining;collagen fibers becamemore regularwith Masson staining，and expression of VEGFwere still strong but less then that atweek 4.Whereas，in the DPB and control groups，the rupture was located at the tendon-bone interface close to themid-tunnel，and loose fibrillar connective tissueswere seen in the stump.Atweek 12，in the PRP+DPB group，the collagenous fiberswere arranged regularly at the rupture site，and some spindly cells interspersed in it;the oblong cells presented dielectial dyeing around them with Alcian blue staining，and the expression of VEGFwasweak.Atweek 24，in the stump，therewere compact fibrous tissues and irregular collagenous fiber in all the groups;in the PRP+DPB group，oblong cells were detected，and Alcian Blue staining showed dielectial dyeing，which was more obvious than that in the DPB and control groups;VEGF was not detectable in any of the groups.The expression of VEGF in the PRP+DPB group was significantly higher than that in the other two groups atweeks4，8，and 12(allP＜0.05).However，atweek 24，no differencewas detected among the three groups(P＞0.05).Between the DPB and control groups，no significantdifferencewas detected in the levelof VEGF expression atany of the time points(P＞ 0.05).ConclusionsThe weak spot in the tendon-bone healing after anterior cruciate ligament reconstruction is at the tendon-bone interface in early stage(8 week)，and thenmoves to the tendon graft later.PRP can enhance new born tissues growing into the graft and promote the healing process at the tendon-bone junction，and thus strengthen the anti-tensile force in tendon-bone healing.

Tendon-bone healing;Platelet-rich Plasma;Anterior cruciate ligament;Reconstruction;Histology

R－332

A

1009－6604(2012)06－0569－06

2011－08－29)

2012－02－17)

·短篇論著·