閆 巍 徐 智

(北京大學(xué)第三醫(yī)院普外科，北京 100191)

結(jié)直腸癌TNM分期與循環(huán)DNA水平關(guān)系的臨床研究

閆 巍 徐 智*

(北京大學(xué)第三醫(yī)院普外科，北京 100191)

目的 探討結(jié)直腸癌TNM分期與循環(huán)DNA水平的關(guān)系。 方法 選擇2010年3月～2011年9月42例結(jié)直腸癌患者，術(shù)前檢測循環(huán)DNA和癌胚抗原(CEA)水平，術(shù)后病理確定TNM分期;同期檢測14例健康人循環(huán)DNA水平作為對照組。 結(jié)果 健康人循環(huán) DNA水平(22.14±16.16)μg/L，結(jié)直腸癌循環(huán) DNA水平:Ⅰ期(79.85±53.08)μg/L，Ⅱ期(77.21 ±40.46)μg/L，Ⅲ期(85.66 ±39.87)μg/L，Ⅳ期(145.52 ±51.72)μg/L。結(jié)直腸癌Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期循環(huán) DNA 水平明顯高于健康人(P＜0.05);結(jié)直腸癌Ⅳ期明顯高于其他各期，差異有顯著性(P＜0.05);Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期之間循環(huán)DNA水平差異無顯著性(P＞0.05);循環(huán)DNA水平在不同年齡段、性別、腫瘤部位間差異無顯著性(P＞0.05)。CEA與循環(huán)DNA水平之間無直線相關(guān)關(guān)系(r=0.153，P=0.333)。 結(jié)論 循環(huán)DNA水平檢測具有微創(chuàng)、標(biāo)本獲取容易、可重復(fù)檢測的優(yōu)點(diǎn)，它有可能在結(jié)直腸癌早期診斷方面成為有價(jià)值的腫瘤標(biāo)志物。

結(jié)直腸癌;TNM分期; 循環(huán)DNA; 腫瘤標(biāo)志物

循環(huán)DNA是存在于血漿中的DNA，也稱細(xì)胞外DNA或游離 DNA。有數(shù)據(jù)顯示［1］健康人循環(huán)DNA含量極微，約在5μg/L左右。Leon等［2］首先觀察到腫瘤患者循環(huán)DNA水平升高的現(xiàn)象，隨后越來越多的研究表明循環(huán)DNA與腫瘤關(guān)系密切，腫瘤生長過程中不斷釋放DNA進(jìn)入血循環(huán)。循環(huán)DNA水平變化在一定程度上可以反映原發(fā)腫瘤的特征，這為研究腫瘤提供了更方便的途徑。本研究旨在了解結(jié)直腸癌TNM分期與循環(huán)DNA水平的關(guān)系，以及癌胚抗原(CEA)與循環(huán)DNA的相關(guān)關(guān)系。

1 臨床資料與方法

1.1 一般資料

選擇2010年3月～2011年9月間42例結(jié)直腸癌患者作為研究對象，男27例，女15例。年齡39～79歲，平均62.2歲。術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)并進(jìn)行TNM分期:Ⅰ期4例，Ⅱ期7例，Ⅲ期25例，以上各期均行根治性切除術(shù)，Ⅳ期6例，其中肝轉(zhuǎn)移2例行原發(fā)灶+轉(zhuǎn)移灶切除，腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移4例，3例并發(fā)腸梗阻行姑息性腫瘤切除+腸造口術(shù)，1例無腸梗阻行姑息性腫瘤切除。

1.2 方法

1.2.1 循環(huán)DNA檢測 42例結(jié)直腸癌患者術(shù)前取3 ml外周靜脈血，置EDTA抗凝試管中4℃保存，2 h內(nèi)分離血漿:3000 r/min離心10 min，取上清液，再以3000 r/min離心10 min，取上清液，獲完全無血細(xì)胞成分的血漿約1 ml，置－80℃冰箱保存。同期取我院14例健康人體檢血標(biāo)本作為對照組，血漿分離保存方法同上。使用MACHEREY-NAGEL公司NucleoSpin Plasma XSKit試劑盒提取血漿循環(huán)DNA，方法按試劑盒說明進(jìn)行。使用Invitrogen公司Qubit dsDNA HSAssay Kit試劑盒進(jìn)行循環(huán)DNA定量。首先應(yīng)用特異性雙鏈DNA熒光染料和Buffer配制工作液;取5μl標(biāo)準(zhǔn)品與195μl工作液混勻，配成標(biāo)準(zhǔn)品上樣體系;取2μl純化的血漿循環(huán)DNA樣品與198μl工作液混勻，配成樣品上樣體系;最后用Qubit 2.0熒光計(jì)對標(biāo)準(zhǔn)品及血漿樣品進(jìn)行測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出樣品中的DNA含量。

1.2.2 CEA測定 42例結(jié)直腸癌患者術(shù)前取外周血3 ml。使用ABBOTT公司i2000SR化學(xué)發(fā)光儀Architect I系統(tǒng)，采用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析技術(shù)(CMIA)檢測血CEA水平。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2組間循環(huán)DNA的差異采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間差異應(yīng)用One-Way ANOVA，兩兩比較應(yīng)用Student-Newman-Keuls;應(yīng)用Spearman相關(guān)分析檢驗(yàn)CEA與循環(huán)DNA水平相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 不同臨床特征的循環(huán)DNA水平

見表1。結(jié)直腸癌循環(huán)DNA水平在不同年齡段、性別、腫瘤部位之間差異無顯著性(P=0.293，0.244，0.135)。健康人與結(jié)直腸癌Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者5組間循環(huán)DNA水平差異有顯著性(F=12.530，P=0.000)。結(jié)腸癌Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期循環(huán)DNA水平明顯高于健康人(q=3.800，4.441，7.103，9.439，P ＜0.05);結(jié)直腸癌Ⅳ期出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(肝轉(zhuǎn)移、腹腔轉(zhuǎn)移)，循環(huán)DNA水平明顯高于Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期(q=3.798，4.583，4.915，P ＜0.05);Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期之間循環(huán)DNA水平差異無顯著性(P ＞0.05)。

表1 不同年齡段、性別、腫瘤部位、TNM分期結(jié)直腸癌患者循環(huán)DNA水平(±s)

表1 不同年齡段、性別、腫瘤部位、TNM分期結(jié)直腸癌患者循環(huán)DNA水平(±s)

*患者與健康人共5組比較

項(xiàng)目 n 循環(huán)DNA(μg/L)統(tǒng)計(jì)值健康人14 22.14 ±16.16患者 42 92.25 ±46.88年齡段 39～50歲 7 73.90±62.42 F=1.267，P=0.293 51 ～70 歲 24 90.00 ±39.44 70 ～79 歲 11 108.82 ±50.44性別 男 27 98.59 ±45.57 t=1.182，P=0.244女15 80.83 ±48.60腫瘤部位 盲腸升結(jié)腸 8 111.85±54.58 F=1.970，P=0.135橫結(jié)腸 4 114.23 ±14.13降結(jié)腸乙狀結(jié)腸 10 65.61 ±53.08直腸 20 93.34 ±40.50 TNM分期 Ⅰ期 4 79.85±53.08 F=12.530，P=0.000*145.52 ±51.72Ⅱ期 7 77.21 ±40.46Ⅲ期 25 85.66 ±39.87Ⅳ期6

2.2 CEA與循環(huán)DNA的相關(guān)性

42例結(jié)直腸癌患者CEA水平呈偏態(tài)分布，0.5～1129 μg/L，中位數(shù)4.6 μg/L。循環(huán)DNA 水平呈正態(tài)分布，(92.25±46.88)μg/L。Spearman 相關(guān)分析顯示，r=0.153，P=0.333，因此 CEA 與循環(huán)DNA之間無明顯直線相關(guān)關(guān)系。

3 討論

結(jié)直腸癌是最常見的腫瘤之一，其病死率和生存率與腫瘤分期有明顯關(guān)系，Ⅰ期5年生存率為95%，Ⅳ期 ＜5%［3］，因此，對結(jié)直腸癌早期診斷并進(jìn)行正確治療可以明顯提高生存率。目前常用的結(jié)直腸癌的篩查方法是糞便潛血試驗(yàn)、CEA和結(jié)腸鏡檢查，但糞便潛血試驗(yàn)和 CEA 的敏感性較低［4，5］，結(jié)腸鏡屬有創(chuàng)性操作，且費(fèi)用偏高［6］，因此，近些年人們對循環(huán)DNA作為腫瘤早期診斷方法的興趣日益濃厚［7］。

3.1 TNM分期與循環(huán)DNA水平的關(guān)系

研究表明乳腺癌患者循環(huán)DNA水平比健康人明顯增高，而且不依賴于腫瘤的大小和分期［8］;對肺癌的研究表明循環(huán)DNA水平在Ⅰa期已明顯增高，并且循環(huán)DNA水平在不同性別、年齡、組織分型、腫瘤分期之間沒有明顯差別［9］。本研究顯示Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期結(jié)直腸癌患者循環(huán)DNA水平均較健康人明顯升高，Ⅳ期出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移和腹腔轉(zhuǎn)移后，循環(huán)DNA水平較其他各期(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期)又明顯升高，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期之間循環(huán)DNA水平差異無顯著性，而且其水平與年齡段、性別、腫瘤部位無明顯關(guān)系，因此，循環(huán)DNA水平在結(jié)直腸癌早期(Ⅰ期)即已增高的現(xiàn)象對腫瘤早期診斷具有參考意義，它有可能成為結(jié)直腸癌早期診斷的較敏感指標(biāo)。

3.2 CEA與循環(huán)DNA的相關(guān)性

CEA是結(jié)直腸癌應(yīng)用最廣泛的血清標(biāo)志物，它診斷早期癌的敏感性約為30% ～40%［4，10］。有研究報(bào)道應(yīng)用循環(huán)DNA診斷結(jié)直腸癌的敏感性為81.3%，而聯(lián)合CEA和循環(huán)DNA檢測敏感性上升到88%［5］。本組資料顯示，結(jié)直腸癌患者 CEA和循環(huán)DNA水平之間無明顯的直線相關(guān)關(guān)系，這種非線性相關(guān)關(guān)系可能正是CEA與循環(huán)DNA聯(lián)合檢測可以提高結(jié)直腸癌診斷敏感性的理論依據(jù)。CEA和循環(huán)DNA水平聯(lián)合檢測有可能成為一種快速微創(chuàng)的、相對價(jià)廉的、更加敏感的早期診斷結(jié)直腸癌的工具［5］。

總之，循環(huán)DNA水平測定具有微創(chuàng)、標(biāo)本獲取容易、可重復(fù)檢測的優(yōu)點(diǎn)，它有希望在結(jié)直腸癌的早期診斷方面成為有價(jià)值的腫瘤標(biāo)志物。

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(責(zé)任編輯:王惠群)

Correlation between the TNM Staging and Levelof Circulating DNA in Colorectal Cancer:Clinical Study

YanWei，XuZhi.DepartmentofGeneralSurgery，PekingUniversityThirdHospital，Beijing100191，China

ObjectiveTo investigate the correlation between the TNM staging and level of circulating DNA in colorectal cancer.MethodsA total of 42 patients with colorectal cancer，who were admitted to our hospital from March 2010 to September 2011，were enrolled into this study.In all the cases，we determined the levels of circulating DNA and CEA preoperatively and TNM staging postoperatively.Meanwhile，the level of circulating DNA was detected in 14 healthy adults as a control group.ResultsThe mean level of circulating DNA was(22.14 ±16.16)μg/L in healthy adults，which was significantly lower than that detected in the stagesⅠ，Ⅱ，Ⅲ，and Ⅳ colorectal cancer［(79.85 ±53.08)μg/L，(77.21 ± 40.46)μg/L，(85.66 ± 39.87)μg/L，and(145.52 ±51.72)μg/L，respectively，allP＜0.05］.In the cases of colorectal cancer，patients in stage Ⅳ showed significantly higher level of circulating DNA than other stages(allP＜0.05).No significantdifferencewas detected among the stagesⅠ，Ⅱ andⅢ(P＞0.05)，nor among different age groups，sex groups，or patients with the tumor at different positions(P＞ 0.05).No linear correlation existed between the levels of CEA and circulating DNA(r=0.153，P=0.333).ConclusionsDetection of circulating DNA has advantages of minimal invasion，easy access to specimen，and repeatability.It can be a valuable tumor marker in early diagnosis of colorectal cancer.

Colorectal cancer;TNM Staging;Circulating DNA;Tumormarker

R735.04

A

1009－6604(2012)06－0512－03

* 通訊作者，E-mail:xuzhi123456@sohu.com

2012－03－27)

2012－05－02)

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