李冬雪，高 珂，宋詩(shī)迎，徐 娜，姜長(zhǎng)陽(yáng)

（遼寧師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116081）

1 引言

馬先蒿（Pedicularis resupinata）屬于玄參科，多年生草本植物，生長(zhǎng)于草地、林緣、濕草甸子、針葉林下、山坡灌叢中和雜木林等環(huán)境中［1，2］，在我國(guó)的遼寧等地區(qū)有分布［3］，近年來(lái)也有栽培［4］。馬先蒿是一種藥用植物，具有多種藥用價(jià)值［5］。近年來(lái)，有關(guān)園藝工作者在對(duì)遼寧地區(qū)的野生植物進(jìn)行調(diào)查研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，分布于遼寧南部的馬先蒿，具有株型美觀(guān)、花色美麗、花期較長(zhǎng)、抗逆性較強(qiáng)等特點(diǎn)，適于進(jìn)行觀(guān)賞栽培。但是，由于多年來(lái)人們大量的采集藥用，野生馬先蒿的數(shù)量已很稀少，難以通過(guò)直接挖取野生的植株進(jìn)行觀(guān)賞栽培。同時(shí)，由于馬先蒿在野生條件下結(jié)種數(shù)很少，也使其無(wú)法通過(guò)采集的種子進(jìn)行繁殖。為此，研究者采用組織培養(yǎng)的方法建立馬先蒿的無(wú)性系，以期滿(mǎn)足人們?cè)耘嗟男枰?。雖然已有馬先蒿研究的報(bào)道［6，7］，但迄今未見(jiàn)馬先蒿組織培養(yǎng)及無(wú)性系建立研究的報(bào)道。

2 材料與方法

2.1 材料

將大連甘井子區(qū)岔鞍山林下生長(zhǎng)旺盛的馬先蒿植物采回實(shí)驗(yàn)室，作為研究材料。

2.2 材料滅菌

參見(jiàn)王艷等［8］艾蒿研究的滅菌方法進(jìn)行滅菌，即可獲得無(wú)菌嫩莖。

2.3 培養(yǎng)條件

參見(jiàn)張卓等［9］山苦菜研究的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)研究。

2.4 方法

2.4.1 愈傷組織的誘導(dǎo)及分化

將無(wú)菌嫩莖切成長(zhǎng)0.2～0.3cm的莖段（下稱(chēng)嫩莖），將葉柄基部的生長(zhǎng)點(diǎn)切成長(zhǎng)0.1cm具有生長(zhǎng)點(diǎn)的莖段（下稱(chēng)生長(zhǎng)點(diǎn)），將葉片切成邊長(zhǎng)0.3cm的塊狀（下稱(chēng)葉片）后，接種于 MS＋6－BA0.6mg·L－1＋2，4－D2.0mg·L－1和 MS＋6－BA0.6mg·L－1＋2，4－D1.0mg·L－1＋NAA0.3mg·L－1兩種培養(yǎng)基上，進(jìn)行不同材料愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)試驗(yàn)。將獲得的愈傷組織在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)繼續(xù)培養(yǎng)50d，觀(guān)察愈傷組織的分化情況。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)試驗(yàn)重復(fù)2次，每種處理接種100個(gè)材料。

2.4.2 生根培養(yǎng)

將以上由生長(zhǎng)點(diǎn)誘導(dǎo)的愈傷組織分化培養(yǎng)的不定芽從基部切下，接種到以1／3MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的NAA、IAA、IBA和ABT2號(hào)（下稱(chēng)ABT）生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，進(jìn)行不定芽的生根培養(yǎng)。不定芽生根培養(yǎng)試驗(yàn)重復(fù)4次，每種處理接種100個(gè)不定芽。

2.4.3 試管苗移栽與定植

將進(jìn)行著生根繼代增殖培養(yǎng)的試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，置于底部有一層厚約0.2～0.4cm水層的搪瓷盤(pán)中，在光照下煉苗2d后，移栽到上層為6～7cm干凈河沙、下層為肥沃園土的溫室苗床中，進(jìn)行試管苗的移栽試驗(yàn)。移栽試驗(yàn)重復(fù)3次，移栽株數(shù)分別為200株、400株和600株。

把移栽成活的試管苗于6月20日和30日，分2次定植到大連市區(qū)的花壇上，2次共定植1 100株。

3 結(jié)果及分析

3.1 不同材料、不同培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)和分化的影響

培養(yǎng)45d統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表1。由表說(shuō)明，以葉片為材料，在兩種培養(yǎng)基上均不能誘導(dǎo)培養(yǎng)出愈傷組織；以生長(zhǎng)點(diǎn)和嫩莖為材料，在兩種培養(yǎng)基上都能誘導(dǎo)形成愈傷組織，其中生長(zhǎng)點(diǎn)的培養(yǎng)效果好于嫩莖。以生長(zhǎng)點(diǎn)為材料，不僅誘導(dǎo)率最高，而且培養(yǎng)的愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)旺盛。由對(duì)培養(yǎng)過(guò)程的觀(guān)察可知，以生長(zhǎng)點(diǎn)為材料，培養(yǎng)8～10d，有的材料開(kāi)始生長(zhǎng)愈傷組織，之后，隨著生長(zhǎng)愈傷組織數(shù)量的不斷增加，愈傷組織也在不斷地生長(zhǎng)。初期生長(zhǎng)的愈傷組織為黃綠色，后來(lái)為由許多大小不等綠色顆粒組成的半球狀。把在兩種培養(yǎng)基上由生長(zhǎng)點(diǎn)和嫩莖培養(yǎng)的愈傷組織繼續(xù)培養(yǎng)40d，并對(duì)培養(yǎng)過(guò)程進(jìn)行觀(guān)察統(tǒng)計(jì)。觀(guān)察證明：由嫩莖培養(yǎng)的愈傷組織不分化；以生長(zhǎng)點(diǎn)為材料在 MS＋6－BA0.6mg·L－1＋2，4－D2.0mg·L－1培養(yǎng)基上誘導(dǎo)培養(yǎng)的愈傷組織不分化，而在 MS＋6－BA0.6mg·L－1＋2，4－D1.0mg·L－1＋NAA0.3mg·L－1培養(yǎng)基上培養(yǎng)的愈傷組織能分化出不定芽。繼續(xù)培養(yǎng)10d左右可見(jiàn)愈傷組織的上部分化出綠色的芽點(diǎn)，隨后，芽點(diǎn)逐漸生長(zhǎng)為不定芽。繼續(xù)培養(yǎng)到40d時(shí)，平均每塊愈傷組織上能分化出2.8個(gè)高0.8cm左右的不定芽。不定芽具有4～6個(gè)葉片，呈綠色，生長(zhǎng)較旺盛。2次重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果基本一致。以上結(jié)果說(shuō)明，MS＋6－BA0.6mg·L－1＋2，4－D1.0mg·L－1＋NAA0.3mg·L－1培養(yǎng)基是馬先蒿生長(zhǎng)點(diǎn)愈傷組織誘導(dǎo)和分化培養(yǎng)的理想培養(yǎng)基。

表1 不同材料對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

3.2 不同濃度調(diào)節(jié)劑對(duì)不定芽生根培養(yǎng)的影響

接種培養(yǎng)到30d時(shí)觀(guān)察統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表2。在不加生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上，不定芽不能生根；在附加4種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上，不定芽均能生根并生長(zhǎng)為試管苗；其中加ABT10mg·L－1的培養(yǎng)基上生根率最高，達(dá)到了96%，并且試管苗長(zhǎng)勢(shì)旺盛。觀(guān)察表明，將不定芽接種到附加ABT 10mg·L－1的培養(yǎng)基上培養(yǎng)到4d時(shí)可見(jiàn)生長(zhǎng)出白色的根原基，隨后，生根數(shù)不斷增加，根原基很快生長(zhǎng)為白色的根，培養(yǎng)到30d時(shí)生根率為96%、生根數(shù)為7.6條／株、株高4.1～5.3cm，并且試管苗長(zhǎng)勢(shì)旺盛。把在1／3MS＋ABT 10mg·L－1這種培養(yǎng)基上生根培養(yǎng)的試管苗剪成長(zhǎng)1.5cm左右、具有2個(gè)生長(zhǎng)點(diǎn)的不定芽，接種到相同的培養(yǎng)基上進(jìn)行試管苗的生根繼代增殖培養(yǎng)，28d為一個(gè)生根繼代培養(yǎng)周期，可培養(yǎng)出一代與以不定芽為材料經(jīng)過(guò)30d生根培養(yǎng)長(zhǎng)勢(shì)一致的試管苗，生根率為98.5%，每一代的增殖系數(shù)為2.9。生根繼代增殖培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)了6代，其結(jié)果基本一致，4次重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果也基本一致。以上結(jié)果說(shuō)明：1／3MS＋ABT 10mg·L－1這種培養(yǎng)基是馬先蒿不定芽生根培養(yǎng)和試管苗生根繼代增殖培養(yǎng)的理想培養(yǎng)基。

表2 不同濃度生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)不定芽生根培養(yǎng)的影響

3.3 試管苗移栽與定植

移栽8d左右可見(jiàn)試管苗開(kāi)始生長(zhǎng)，30d時(shí)統(tǒng)計(jì)，分別成活182株、373株和566株。共成活1 121株，平均成活率為93.4%，成活率較高。

定植后30d統(tǒng)計(jì)證明：共成活1 082株，定植成活率為98.5%。這說(shuō)明，在溫室中移栽成活的試管苗，容易定植成活。

對(duì)定值成活的試管苗的觀(guān)察表明：定植成活的試管苗不僅保持了野生馬先蒿葉色濃綠，生長(zhǎng)旺盛，根系約為野生同齡植株的1.5倍，當(dāng)年不開(kāi)花、翌年7月中旬開(kāi)花、8月結(jié)果等植物學(xué)性狀，還保持了株型美觀(guān)、花色美麗、花期較長(zhǎng)、抗逆性較強(qiáng)等有利于觀(guān)賞的特點(diǎn)。

4 結(jié)語(yǔ)

本研究定植的馬先蒿試管苗不僅保持了野生馬先蒿的植物學(xué)性狀，而且還保持了株型美觀(guān)、花色美麗、花期較長(zhǎng)、抗逆性較強(qiáng)等有利于觀(guān)賞的特點(diǎn)。這一結(jié)果說(shuō)明：本研究所獲得的試管苗可作為觀(guān)賞栽培的種苗使用，所建立的培養(yǎng)技術(shù)也為該物種種質(zhì)保存奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

在本研究的試管苗生根繼代增殖培養(yǎng)中，28d為一個(gè)培養(yǎng)周期，每個(gè)培養(yǎng)周期的增殖系數(shù)為2.9。按照這種繁殖速度，一株試管苗每年可以繁殖出2.913（約為99萬(wàn)）株試管苗。除掉各種不利因素影響，每年完全能保證繁殖出50萬(wàn)株試管苗，這種繁殖速度完全能滿(mǎn)足栽培對(duì)種苗的大量需求。

［1］韓全忠，王振興.大連地區(qū)植物志（中冊(cè)）［M］.大連：大連理工大學(xué)出版社，1993：673.

［2］中國(guó)科學(xué)院植物研究所.中國(guó)高等植物圖鑒（第四冊(cè)）［M］.北京：科學(xué)出版社，1975：71.

［3］李書(shū)心.遼寧植物志（下冊(cè)）［M］.沈陽(yáng)：遼寧科學(xué)技術(shù)出版社，1991：336.

［4］包滿(mǎn)珠.花卉學(xué)［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2004：431～414.

［5］南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典（上冊(cè)）［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2008：394.

［6］王 靜，唐 王.馬先蒿屬野生花卉引種的可行性研究［J］.中國(guó)林副特產(chǎn)，2005（1）：5～7.

［7］王 薇，鄒艷敏，張 莉.馬先蒿屬植物的現(xiàn)代研究進(jìn)展［J］.西北藥學(xué)雜志，2006，21（3）：142～144.

［8］王 艷，張 卓，王曉旭，等.艾蒿生長(zhǎng)點(diǎn)及試管苗培養(yǎng)的研究［J］.遼寧大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，36（4）：353～357.

［9］張 卓，王 艷，李 慧，等.山苦菜無(wú)性系建立的研究［J］.河南大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，42（2）：187～191.