陳克研，張 賀，陳振文，王 洋，王承利

（1.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院實驗動物科，沈陽 110840；2.首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院實驗動物學系，北京 100069）

巴馬小型豬源于廣西巴馬瑤族自治縣［1］，由于其體型小、遺傳性狀穩(wěn)定且在解剖學和生理生化等方面與人有較大的相似性，目前廣泛應用于心腦血管疾病、皮膚病及消化系統(tǒng)疾病的外科手術及模型制作中［2，3］，而實驗動物的質量是實驗成功的前提。大腸埃希菌是近年來嚴重危害小型豬飼養(yǎng)的主要疾病之一［4］，由于其血清型較多，且對多數(shù)抗生素存在耐藥性，給該病的防治帶來一定的困難。本研究對疑似細菌感染的巴馬小型豬進行檢測，確診為豬大腸埃希菌感染。此外，本實驗對分離的菌株耐藥性進行分析，篩選出治療用特效藥物，為小型豬大腸埃希菌病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源：沈陽軍區(qū)總醫(yī)院實驗動物科于2012年3月先后從異地購進巴馬小型豬20頭，在例行常規(guī)檢驗時發(fā)現(xiàn)3頭豬臨床表現(xiàn)異常，并伴隨腹瀉癥狀，立即用無菌棉拭子從這三頭豬的直腸處采集樣本，做進一步分析。

1.1.2 主要試劑：美藍染液、革蘭染液、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、普通肉湯培養(yǎng)基、葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、乳糖、蔗糖、枸櫞酸鹽等試劑購自沈陽博洋生物技術有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA Marker DL-2000均為TaKaRa公司產(chǎn)品；大腸埃希氏菌O型抗血清購自中國獸藥監(jiān)察所。

1.1.3 實驗動物：清潔級雌性昆明小鼠20只，體重12～25 g，由沈陽軍區(qū)總醫(yī)院實驗動物科提供（生產(chǎn)許可證號：SCXK（軍）2007-001；使用許可證號： SYXK（軍）2007-001）。

1.2 方法

1.2.1 鏡檢：將棉拭子采集的直腸樣本直接涂抹到無菌蓋玻片上，按常規(guī)染色技術分別對其進行美藍和革蘭染色，顯微鏡下油鏡觀察。

1.2.2 細菌分離培養(yǎng)：將棉拭子樣本用無菌 PBS （0.01 mol/L pH 7.4）處理后按1％的濃度接種普通肉湯培養(yǎng)基；37℃培養(yǎng)24 h后，用接種環(huán)粘取培養(yǎng)物，分別在麥康凱培養(yǎng)基和伊紅美藍培養(yǎng)基中進行劃線培養(yǎng)；37℃培養(yǎng)24 h后，挑取單個菌落，進行革蘭染色，顯微鏡下油鏡觀察。

1.2.3 PCR鑒定：依據(jù)豬大腸埃希菌的毒力因子基因序列設計大腸埃希菌通用引物：上游 5＇-TCCTCAGCTATAGGGTGC-3＇，下游 5＇-ATCGAAAC AAGGCCAGTT-3＇；和大腸埃希菌特異性引物：上游5＇-CAGGTCGTCGTGTCTGCTAAA-3＇，下游 5＇-TCA GCGTGGTTGGATCAACCT-3＇，由華大基因公司合成；以分離的細菌為模板進行PCR鑒定［5］。

1.2.4 生化試驗：將分離的菌株分別接種葡萄糖、甘露醇、麥芽糖、枸櫞酸鹽等微量糖發(fā)酵管，37℃培養(yǎng)24 h后，觀察結果。

1.2.5 血清型鑒定：將16種大腸埃希菌標準O型血清用石炭酸生理鹽水分別作4倍稀釋，吸取20 μL于無菌載玻片上，然后粘取加熱處理后的大腸埃希菌“O”抗原于血清中混勻；若有凝集顆粒出現(xiàn)判為陽性，若5 m in內不出現(xiàn)凝集顆粒則為陰性。

1.2.6 致病性實驗：取清潔級昆明小鼠20只，隨機分為4組，每組5只，腹腔注射分離的細菌，0.2 mL/只（約2×108CFU），第5組腹腔注射普通肉湯，做陰性對照；隔離飼養(yǎng)，逐日觀察。

1.2.7 病毒檢測：將采集的棉拭子樣本用無菌PBS （0.01 mol/L pH 7.4）制成乳懸液；用2％磷鎢酸負染，電鏡觀察是否有病毒粒子。

1.2.8 藥敏試驗：將分離鑒定后的菌株接種普通肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)液均勻涂布于普通瓊脂培養(yǎng)基中；分別將頭孢他叮等25種抗生素紙片貼于平皿中；37℃培養(yǎng)24 h后觀察抑菌環(huán)大小。以上使用的25種藥物分別為：青霉素、鏈霉素、紅霉素、磷霉素、四環(huán)素、磺胺脒、利福平、慶大霉素、克拉霉素、呋喃妥因、新生霉素、美滿霉素、頭孢呋新、復方新諾明、氨芐青霉素、妥布霉素、左氟沙星、丁胺卡那霉素、頭孢他叮、乙基西梭霉素、先鋒必/舒巴坦、丙氟哌酸、磺胺嘧啶、菌必治、頭孢氨噻肟。

2 結果

2.1 鏡檢

采集直腸棉拭子樣本觸片后經(jīng)美藍染色，可在鏡下見到明顯的短桿菌；革蘭染色后可見兩端鈍圓且顯紅色的革蘭陰性菌。

2.2 分離培養(yǎng)特性

采集的棉拭子經(jīng)無菌PBS處理后，接種普通肉湯培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后可見試管混濁且在底部存在不易分散的黏稠沉淀物；進一步接種麥康凱培養(yǎng)基，有單一的磚紅色光滑菌落出現(xiàn)；伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基上則出現(xiàn)紫黑色帶金屬光澤的菌落落；分別挑取上述單個菌落進行革蘭染色，鏡下油鏡觀察，均為革蘭陰性的 短桿菌。

2.3 PCR鑒定結果

應用PCR對3個樣本進行鑒定，結果如圖1所示，3個菌株分別經(jīng)大腸埃希菌通用引物及大腸埃希菌特異性引物PCR擴增后，均可擴增出1797 bp和750 bp的目的片段，初步判定為同一株大腸埃希菌。

2.4 生化試驗結果

取3株分離菌的典型菌落進行生化試驗，結果如表1所示，3株細菌的生化鑒定結果一致，均能分解葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇及蔗糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣。

圖1 PCR鑒定結果Fig.1 The identification results by PCR

表1 生化鑒定結果Tab.1 Result of biochemistry identify

2.5 血清型鑒定結果

使用豬大腸埃希菌O型抗血清對分離的3個菌株鑒定，結果3個菌株的血清型均為O138。

2.6 致病性試驗結果

試驗組小鼠在接種后12 h，表現(xiàn)畏光拱背；小鼠24 h后出現(xiàn)死亡，72 h后，小鼠全部發(fā)病，死亡率達60％；剖檢死亡小鼠可見脾臟腫大并伴有充血；無菌取心臟、肝臟和脾臟進行觸片，染色鏡檢，同時進行細菌分離培養(yǎng)，結果分離的細菌與巴馬小型豬病料中分離的一致，提示該菌株有一定的致病性。

2.7 病毒分離試驗結果

病料經(jīng)電鏡觀察未發(fā)現(xiàn)有病毒樣粒子。

2.8 藥敏試驗結果

以抑菌環(huán)直徑大小作為對藥物敏感性的判定標準，結果如表2所示，該菌株僅對青霉素、鏈霉素、頭孢曲松和呋喃妥因4種藥物敏感，對磷霉素、磺胺脒、左氟沙星等高度耐藥。

3 討論

大腸埃希菌是嚴重危害小型豬飼養(yǎng)的主要疾病之一，本文對10日齡左右的巴馬小型豬進行檢查時發(fā)現(xiàn)3頭豬表現(xiàn)異常，并伴有腹瀉?？剖胰藛T立即采集直腸樣本進行檢驗，通過常規(guī)的美藍及革蘭染色，鏡下觀察確定其為革蘭陰性的短桿菌；將其接種麥康凱和伊紅美藍培養(yǎng)基，其生長特征與大腸埃希菌一致的；進一步通過PCR驗證，初步判斷分離的細菌為大腸埃希菌。此外，由于病毒性疾病也容易伴發(fā)腹瀉癥狀，本文將采集的病料處理后通過電鏡觀察，未發(fā)現(xiàn)病毒粒子，從而排除病毒性疾病的可能。在臨床診斷時遇到異常癥狀，應詳細收集臨床資料，了解病程綜合分析，查閱文獻后進行鑒定。

目前，細菌性疾病大多應用抗生素進行治療，但由于細菌本身血清型較多，再加上臨床存在濫用抗生素的現(xiàn)象［7］，導致大多數(shù)菌株存在耐藥現(xiàn)象。李云龍［8］等對5種血清型大腸埃希菌進行耐藥分析時發(fā)現(xiàn)各類型菌株的耐藥率最高達到96.8％。姜中其等［9］采用Kirby-Bauer法檢測60株大腸埃希菌，結果有57株呈耐藥譜型。本研究應用25種抗菌藥物對分離的大腸埃希菌進行藥敏試驗，結果僅青霉素、鏈霉素、頭孢曲松和呋喃妥因對其敏感。由此可見，大腸埃希菌的耐藥性在臨床中普遍存在，在臨床用藥時應先進行藥敏試驗，篩選出高效敏感的藥物進行治療。

目前，國外用于生命科學和生物醫(yī)學研究用的小型豬大多在SPF級水平［10］，我國雖具有獨特的小型豬資源，但還未見成型的質量標準，在某種層面上影響了比較醫(yī)學資料的形成。因此，如何排除小型豬的病原體，保證小型豬相關研究的質量，便顯得尤為重要。本研究通過細菌學檢測技術及分子生物學技術分離鑒定出引起巴馬小型豬腹瀉的菌株為大腸埃希菌；進一步通過藥敏實驗篩選出對其敏感的特效藥物，一方面為小型豬疾病的發(fā)生和防治提供理論依據(jù)，另一方面為小型豬的生物進化和種群建立奠定基礎。

表2 藥敏試驗結果Tab.2 Result of resistance test

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