劉 偉，余英豪

（中國人民解放軍南京軍區(qū)福州總醫(yī)院病理科，福州 350025）

人體的抗腫瘤免疫反應主要是由激活的T淋巴細胞介導，T細胞激活需要雙信號系統(tǒng)，第一信號是由T細胞受體（TCR）與抗原肽-MHC復合物相結合所提供，第二信號是由輔助分子或共刺激分子通過與T細胞上相應受體結合而傳遞的，其中以B7分子的共刺激作用最為重要，而腫瘤細胞表面往往缺乏或低表達B7分子，是腫瘤細胞逃避宿主免疫系統(tǒng)監(jiān)視和滅殺的重要機制之一［1］。因此，通過轉(zhuǎn)基因使腫瘤細胞表達 B7分子，為 T淋巴細胞激活提供第二信號，從而激活T細胞發(fā)揮抗腫瘤效應。MIP-1α類屬 CC趨化因子，與其相應受體結合后誘導趨化T細胞、單核細胞、樹突狀細胞、NK細胞等免疫細胞，募集到腫瘤局部，產(chǎn)生抗腫瘤效應［2，3］。

從理論上推測，趨化因子 MIP-1α和共刺激分子B7-1基因轉(zhuǎn)染淋巴瘤細胞后，機體抗淋巴瘤免疫作用可能會明顯增強。為此，本研究擬建立重組表達小鼠MIP-1α和B7-1基因的慢病毒載體，為淋巴瘤基因治療的實驗研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 慢病毒載體：慢病毒載體pGC-FU Vector購自上海吉凱基因化學技術有限公司。

1.1.2 菌株來源：大腸桿菌 DH5α由本實驗室保存。

1.1.3 細胞株：293T細胞，由本實驗室保存。

1.1.4 主要試劑：1 kp DNA ladder Marker，250 bp DNA ladder Marker（Fermentas公司）；AgeI，（NEB公司）；In-Fusion kit（BD 公 司）；Taq polymerase （SinoBio公司）；Plasm id抽提Kit（Promega公司）；一抗 Mouse Anti-GFP，二抗 Goat Anti-Mouse（Santa-Cruz公司）；Lipofectamine2000（Invitrogen公司）；MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶（PROMEGA公司）。

1.1.5 主要儀器和器材：PCR 儀（Applied Biosystems公司）；穩(wěn)壓DNA電泳儀（BioRad公司）； SDS-PAGE蛋白電泳儀，蛋白轉(zhuǎn)膜儀（上海天能公司）；5417R臺式冷凍高速離心機（Eppendorf公司）；陽性克隆測序在上海美季生物技術公司完成。

1.2 方法

1.2.1 MIP-1α和 B7-1基因重組慢病毒載體的構建：

（1）慢病毒載體酶切 使用 AgeI進行酶切消化，50μL反應體系，含 ddH2O 42μL，10×buffer 5μL，純化的 DNA質(zhì)粒（1 ug/μL）2μL，AgeI （5 U/μL）1μL，將上述混合的反應物置37℃ 2 h。

（2）目的基因片段獲取 從 GeneBank中查尋小鼠MIP-1α和B7-1基因序列，設計引物，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

①引物合成 設計B7-1和 MIP-1α基因引物（表1）

②PCR擴增目的基因 分別以 Primer（+）： MIP-1α-AgeI-F，Primer（-）：MIP-1α-AgeI-R 和Primer（+）：B7-1-AgeI-F，Primer（-）：B7-1-AgeI-R為引物，進行目的基因 MIP-1α和 B7-1的 PCR擴增。反應體系為20μL，目的基因M IP-1α的PCR反應循環(huán)條件：94℃ 5 min→（94℃ 30 s→55℃ 30 s→72℃ 30 s）30循環(huán)→72℃ 10 m in→4℃ +∞；目的基因B7-1的PCR反應循環(huán)條件：94℃ 5 min→（94℃30 s→55℃ 30 s→72℃ 1 m in）30循環(huán)→72℃ 10 min→4℃+∞。

（3）重組克隆制備

①感受態(tài)制備 用氯化鈣制備大腸桿菌感受態(tài)細胞，并分裝置-70℃凍存。

②PCR產(chǎn)物交換進入線性化慢病毒載體（表2）。

表1 B7-1和MIP-1α基因引物Tab.1 The primers of B7-1 and MIP-1 gene

表2 PCR產(chǎn)物反應體系Tab.2 PCR reaction system

于25℃ 反應30 min，再于42℃ 反應15 min，制備克隆交換液，準備轉(zhuǎn)化。陽性對照和自連對照，加入的載體和連接組一致，但陽性對照加入的純化PCR產(chǎn)物為GAPDH基因（同樣帶有交換臂）。

③轉(zhuǎn)化按說明進行轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞并轉(zhuǎn)移到Amp抗性（100 ug/m L）的LB瓊脂培養(yǎng)基上，長出的克隆進行后續(xù)PCR鑒定。

（4）陽性克隆的PCR鑒定 在長出的克隆菌表面沾一下，溶于10μL LB，混勻后取1μL作為菌落PCR模板；分別以 PCR引物：Primer（+）：Ubi-F； Primer（-）：EGFP-N-R進行 PCR擴增。PCR反應體系為20μL。目的基因MIP-1α的PCR條件：94℃2 min→94℃ 30 s→60℃ 30 s→72℃ 30 s）30循環(huán)→72℃ 6 min→4℃ +∞。目的基因 B7-1的 PCR條件：94℃ 2 min→（94℃ 30 s→60℃ 30 s→72℃ 1 m in）30循環(huán)→72℃ 6 min→4℃ +∞。設陰性對照，自連對照，陽性對照。

1.2.2 Western blot檢測目的基因質(zhì)粒表達：

重組 MIP-1α和 B7-1目的基因質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T細胞，24 h后觀察熒光表達情況，收集轉(zhuǎn)染成功的細胞，加入細胞裂解液裂解抽提蛋白，按照Western blot實驗技術操作說明分別進行檢測，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗Mouse Anti-GFP，二抗Goat Anti-Mouse，進行雜交、洗膜等操作后，曝光、顯影定影。

1.2.3 重組慢病毒載體的包裝及滴度測定：

（1）慢病毒的包裝 重組慢病毒pGC-LV載體，pHelper 1.0載體和pHelper 2.0載體組成的三質(zhì)粒系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293T細胞，按照 Lipofectam ine 2000的說明書操作。收集轉(zhuǎn)染后48 h的293T細胞上清液，離心濃縮后分裝在病毒管中，-80℃長期保存。取其中一支行病毒滴度測定。

（2）實時熒光定量PCR法測定慢病毒滴度

①樣品制備 檢測前1天，對293T細胞傳代，每個24孔中加1×105個細胞。次日，準備7～10個無菌的 Ep管，在每個管中加入 90μL培養(yǎng)基（DMEM+10％FBS）。取待測病毒原液10μL加入到第一管中，混勻后，取10μL加入到第二管中。繼續(xù)相同的操作直到最后一管。第1個Ep管中加入10 uL病毒原液，記為1E+1μL；第二個 Ep管中進行了第1次10倍稀釋，所得病毒原液為第1個 Ep中的1/10，記為1E+0μL；依次類推…，第7個Ep管中進行了第6次10倍稀釋，所得病毒原液為第6個Ep中的1/10，記為1E-5μL。

②總 RNA 抽提 根據(jù) Invitrogen公司的TRIZOL操作說明書進行，均為RNase-free操作。紫外分析測定所抽提RNA的濃度。

③RNA逆轉(zhuǎn)錄獲cDNA 目的基因GFP：上游引物：5＇-TGCTTCAGCCGCTACCC-3＇，下游引物：5＇-AGTTCACCTTGATGCCGTTC-3＇；ACTIN基因：上游引物：5＇-GTGGACATCCGCAAAGAC-3＇，下游引物： 5＇-AAAGGGTGTAACGCAACTA-3＇。

按Promega公司的M-MLV操作說明書進行，均為RNase-free操作。RT反應體系11μL，得到的RT反應產(chǎn)物cDNA立即用于PCR，部分保存在-80℃冰箱中。

④實時熒光定量PCR檢測 Real-time PCR在Bio-rad的iQ5上完成?？偡磻w系20μL，設定程序為兩步法Real-Time定量：預變性95℃ 15 s，之后每一步變性95℃ 5 s，退火延伸60℃ 30 s，共40個循環(huán)。每次在延伸階段讀取吸光值。制作熔解曲線：PCR結束后，再95℃變性1 m in，冷卻至55℃，使DNA雙鏈充分結合。從55℃開始到95℃，每一步增加 0.5℃，保持 30 s，同時讀取吸光值。

2 結果

2.1 慢病毒載體pGC-FUVector酶切后瓊脂糖凝膠電泳圖譜（圖1）。

圖1 慢病毒載體pGC-FU Vector酶切后瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.1 The agarose gel electrophoresis result of Lentiviral vector pGC-FU

2.2 目的基因 MIP-1α和B7-1PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜（圖2）。

2.3 陽性克隆的PCR鑒定

（1）MIP-1α陽性轉(zhuǎn)化子得到483 bp的條帶，陰性轉(zhuǎn)化子得到198 bp的條帶，初步表明 MIP-1α基因重組慢病毒載體構建成功（圖3）。

（2）B7-1陽性轉(zhuǎn)化子得到1125 bp的條帶，陰性轉(zhuǎn)化子得到198 bp的條帶，初步表明 B7-1基因重組慢病毒載體構建成功（圖4）。

2.4 陽性克隆測序結果及結果分析

接種陽性轉(zhuǎn)化子，37℃ 培養(yǎng)16 h保存為甘油菌，分別分裝200μL送上海美季生物技術有限公司進行雙向序列測序，比對分析證實，MIP-1α和B7-1基因測序結果與目標序列完全一致。

2.5 重組 MIP-1α和 B7-1目的基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞，48h后的熒光蛋白表達情況（彩插4圖5～6）。

2.6 WesternBlot檢測結果

Western blot檢測結果顯示 MIP-1α基因融合GFP和B7-1基因融合 GFP在293T細胞中都獲得表達（彩插4圖7～8）。

圖2 目的基因MIP-1α和B7-1 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.2 The agarose gel electrophoresis results of targetsegments of M IP-1αand B7-1 gene

圖3 MIP-1α轉(zhuǎn)化子的PCR擴增產(chǎn)物電泳結果圖Fig.3 The electrophoresis results of target segment of M IP-1αgene

2.7 重組MIP-1α慢病毒滴度測定

（1）實時定量PCR曲線圖（圖9）

（2）不同濃度病毒感染后樣品組的 Ct值及表達量分析（表3）

加入不同病毒量的細胞樣品，通過比較control

圖4 B7-1轉(zhuǎn)化子的PCR擴增產(chǎn)物電泳結果圖Fig.4 The electrophoresis results of target segment of B7-1 gene

圖9 加入不同重組M IP-1α慢病毒量的細胞樣品隨著PCR循環(huán)的增加，熒光值開始上升，經(jīng)過40個循環(huán)后均達到峰值Fig.9 Fluorescence curve in different M IP-1αgene groups gradually rose with the PCR process and reached the peak after 40 cycles

表3 病毒感染后樣品組的Ct值及表達量Tab.3 The Ct values of different groups infected with virus

組和試驗組的Ct值差異判斷滴度值。判斷標準為Ct值差異 ＞2即存在顯著差異。反轉(zhuǎn)錄反應所獲得的20μLcDNA中只取了1μL用于實時定量檢測，該結果僅表示1/20樣品的情況，所以在滴度計算時應該乘以系數(shù)20。

在本次滴度檢測中，1E-4μL組樣品和 control組樣品的差值，即△CtCon-△Ct樣品組=2.075＞2，說明1E-4μL組與control組樣品的Ct值存在顯著差異，證實1E-4μL組樣品中存在病毒顆粒。假定該組樣品含有至少1個病毒顆粒，則病毒的滴度為：1/ （1E-4）*20=2.00E+5 TU/μL=2.00E+8 TU/m L。

（3）目的基因及 Actin基因的熔解曲線（圖10）。

2.8 重組B7-1慢病毒滴度測定

（1）實時定量PCR曲線圖（圖11）。

圖10 Actin基因和目的基因的熔解曲線Fig.10 The melting curve of actin gene and target gene

圖11 加入不同重組B7-1慢病毒量的細胞樣品隨著PCR循環(huán)的增加，熒光值開始上升，經(jīng)過40個循環(huán)后均達到峰值Fig.11 Fluorescence curve in different B7-1 gene groups gradually rose with the PCR process and reached the peak after 40 cycles

（2）不同濃度病毒感染后樣品組的 Ct值及表達量分析（表4）

在本次滴度檢測中，1E-4μL組樣品和1E-5 μL組樣品的 Ct值，即△Ct1E-4μl組-△Ct1E-5μl組= 22.27-19.695=2.575＞2，說明 1E-04μL組與1E-5μL組樣品的 Ct值存在顯著差異，病毒滴度為：1/（1E-4）*20=2.00E+5 TU/μL=2.00E+8 TU/m L。

（3）目的基因及Actin基因的熔解曲線

①Actin基因的熔解曲線（圖12）。

表4 病毒感染后樣品組的Ct值及表達量Tab.4 The Ct values of different groups infected with virus

3 討論

腫瘤基因治療的關鍵是載體的選擇，用于基因治療的載體系統(tǒng)可分為病毒性載體和非病毒性載體兩類。目前常用的病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、皰疹病毒載體、痘苗病毒載體等，但是這些載體均存在不足之處，嚴重影響了基因治療的有效性及安全性。慢病毒載體是以人類免疫缺陷型病毒（HIV）為基礎發(fā)展起來的基因治療載體，它對分裂期細胞和非分裂期細胞均具有感染能力，能夠整合到宿主細胞的基因組中，可以在體內(nèi)長期穩(wěn)定表達，還具有容納外源性目的基因片段大、免疫反應小等優(yōu)點［4］。本研究所用的 Lentivirus為“自殺”性病毒，即病毒感染目的細胞后不會再感染其他細胞，也不會利用宿主細胞產(chǎn)生新的病毒顆粒。慢病毒中的毒性基因已經(jīng)被剔除并被外源性目的基因所取代，屬于假型病毒，但該病毒仍然具有潛在的生物學危險［5，6］。目前，慢病毒載體已被應用于帕金森氏病、鐮狀細胞貧血、血友病、肝癌及結直腸癌等疾病的研究［7-11］。

圖12 Actin基因和目的基因的熔解曲線Fig.12 The melting curve of actin gene and target gene

本研究中，我們自行設計引物合成和PCR擴增目的基因后，將目的基因與酶切線性化的慢病毒載體進行定向連接，其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細菌感受態(tài)細胞，對長出的陽性克隆進行PCR鑒定及直接測序比對分析，證實測序結果與目標基因序列完全一致，表明B7-1和 MIP-1α基因重組慢病毒載體構建成功。B7-1目的基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞，48 h后，在熒光顯微鏡下能夠觀察到＞90％的293T細胞中有強熒光表達；然而為何MIP-1α目的基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞后，只觀察到部分細胞中有熒光表達呢?這是因為小鼠MIP-1α蛋白是分泌蛋白［12］，表達后分泌到胞外，在細胞內(nèi)不能逐漸蓄積所含 M IP-1α蛋白量較少，故僅觀察到部分細胞有熒光蛋白表達。Western Blot檢測到目的基因 B7-1和 MIP-1α融合GFP的表達，進一步證實了目的基因重組載體在293T細胞中的表達。

目前常用的測定慢病毒滴度的方法有孔稀釋法和實時熒光定量PCR，孔稀釋法是根據(jù)目的基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞后的熒光表達情況計算病毒的滴度，由于熒光蛋白的表達程度易受到插入的目的基因片段的影響，從而導致該方法不能準確反映病毒的滴度，從而其應用受到限制。另外，如果目的基因表達的蛋白為分泌蛋白，因轉(zhuǎn)錄翻譯生成的蛋白不能在細胞的胞漿或包膜中蓄積，導致觀察不到或僅觀察到較弱的熒光表達，應用孔稀釋法就難以準確測定病毒滴度。實時熒光定量PCR法檢測病毒基因組RNA的拷貝數(shù)，不受目的基因轉(zhuǎn)錄翻譯生成的蛋白類型和蛋白表達量的影響，既能檢測蛋白表達定位于胞漿及胞膜的目的基因，也能檢測到表達分泌蛋白的目的基因，此方法簡便易行、靈敏度高、特異性好；本研究采用實時熒光定量PCR法檢測到B7-1和MIP-1α基因重組慢病毒載體的滴度均達到2.00E+8 TU/m L；雖然其能夠比較準確的反映慢病毒載體的整合情況，但不能準確反應目的蛋白的實際表達情況［13，14］，其原因可能是由于病毒載體整合入靶細胞異染色質(zhì)中，使目的蛋白表達受到影響。

在應用實時熒光定量PCR檢測重組慢病毒載體滴度的過程中，由熔解曲線來分析產(chǎn)物的均一性有助于更準確地分析實時熒光定量PCR定量結果。由于SYBR GreenⅠ與所有的雙鏈DNA相結合，因此由引物二聚體、單鏈二級結構以及錯誤的擴增產(chǎn)物引起的假陽性會影響定量的精確性。通過測量升高溫度后熒光的變化可以幫助降低非特異產(chǎn)物的影響。熒光強度變化的拐點（熔點，Tm）為熔解峰值。本研究的熔解曲線圖中沒有出現(xiàn)雜峰，也未出現(xiàn)主峰的異常增寬，表明實驗中未出現(xiàn)污染、引物二聚體和非特異性擴增，B7-1和MIP-1α基因重組慢病毒載體的滴度均達2.00E+8 TU/m L。

B7-1和MIP-1α基因重組慢病毒載體的成功構建，為后續(xù)淋巴瘤基因治療奠定了基礎。

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