宋 舸，張俊伶，鞠振宇

（1.中國醫(yī)學科學院，北京協(xié)和醫(yī)學院，醫(yī)學實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021；2.中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所天津市分子核醫(yī)學重點實驗室，天津 300192）

實驗小鼠作為研究間充質干細胞（MSC）功能的載體發(fā)揮著重要作用，傳統(tǒng)獲取小鼠MSC方法主要來自骨髓，利用MSC細胞具有在塑料培養(yǎng)皿上貼壁的特點得到。但是因為小鼠骨髓的MSC數(shù)量很少，并且有造血細胞的污染，常給研究帶來不少不確定因素。此后不斷對此方法進行改進，如通過磁珠分選、逆轉錄病毒轉染等，然而仍舊存在不易標準化，并且有或多或少損傷細胞生物學特性的問題。因此，受到有關人體骨片中獲得MSC的方法的啟發(fā)［1］，我們嘗試通過培養(yǎng)小鼠的下肢皮質微粒骨，同時也由于皮質骨中造血細胞污染機會很少，希望建立獲得小鼠MSC簡便穩(wěn)定的方法。

端粒是真核細胞染色體末端的一種保護性結構，在維持染色體末端穩(wěn)定性等方面起重要作用。端粒被認為是細胞衰老的生物鐘。研究證明端粒的長度隨著人體的衰老呈進行性縮短，端粒的長度與許多衰老相關的疾病密切相關。骨質疏松作為一種與衰老相關的疾病，也與染色體末端端粒功能的異常相關［2］。研究衰老模型的 Terc-/-鼠，經過連續(xù)傳代到第三代（G3），其端粒長度與人接近，而且它的骨骼畸形、骨質疏松的表型也更加容易觀察，因此本實驗以WT鼠和Terc-/-鼠G3為研究對象，通過體外細胞培養(yǎng)建立獲取MSC的方法，初步比較它們的生物學特征，為今后深入研究其各項功能提供技術支持。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

WT鼠和Terc-/-鼠的飼養(yǎng)和使用符合中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所標準。研究使用的小鼠均為G3代，WT為對照。分別取2月齡和9月齡鼠各5只，所用的動物遺傳背景為 C57BL/6。WT鼠購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心［SCXK（軍）2007-004］。

1.2 小鼠皮質骨MSC的分離

小鼠脫頸處死后，浸泡在70％酒精中2 m in，轉入100 mm無菌平皿，切開下肢皮膚，顯微剪刀盡可能分離干凈附著在股骨和脛骨上的肌肉、韌帶，將骨組織放入無菌紗網布上，搓去殘留的肌肉和韌帶。將骨組織置入35 mm無菌平皿中，加入5 m l培養(yǎng)液（α-MEM+1％P/S+2％FBS），為保持MSC細胞活性，操作不易超過2 h。剪去骨兩端的骨骺以便沖洗髓腔內的造血細胞，沖洗至髓腔變白。將骨組織剪成1～3 mm2大小顆粒，轉至25 cm2平皿中，加入3 mLα-MEM（含1 mg/mL膠原酶Ⅱ），在37℃振搖1～2 h。回收消化松散的骨片準備原代培養(yǎng)。

1.3 小鼠皮質骨MSC的原代培養(yǎng)

將經上述分離所得的骨片種于25 cm2平皿中，加入6 m Lα-MEM（含10％FBS及1％P/S），在37℃，5％CO2條件下連續(xù)培養(yǎng)3 d，此間避免不必要的晃動干擾。3 d后更換培養(yǎng)液，棄未黏附的細胞，加入6 m Lα-MEM（含10％FBS及1％P/S）繼續(xù)培養(yǎng)2 d。培養(yǎng)5 d后，棄培養(yǎng)液，加入3 m L 0.25％胰酶+0.02％EDTA（室溫）消化3 m in，回收細胞。骨片仍用于繼續(xù)獲得MSC細胞，方法同前。MSC細胞按每孔細胞1×104個CM2的密度接種于6孔培養(yǎng)板內，加入α-MEM（含10％FBS及1％P/S）培養(yǎng)液，于37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)；接種3 d后進行第1次換液，以后隔日換液。每天隨機抽取3只實驗動物的MSC作細胞生長動力學觀察，直至貼壁細胞鋪滿整個培養(yǎng)孔的底部。

1.4 小鼠皮質骨MSC的傳代培養(yǎng)及 MSC的增殖分析

原代培養(yǎng)一旦鋪滿整個培養(yǎng)孔的表面，即可用0.25％胰酶+0.02％EDTA液消化分離（18～25℃，3 min）貼壁細胞，傳代接種培養(yǎng)的比例1∶3，標記為P1，隔日換液，至貼壁細胞鋪滿培養(yǎng)孔的底面。再重復以上操作，進行下一代傳代接種培養(yǎng)，標記為P2，余類推。抽取3只實驗動物MSC由P1代開始，逐代進行傳代培養(yǎng)，直至培養(yǎng)細胞出現(xiàn)衰老征象，停止傳代培養(yǎng)。以細胞群體倍增值（population doublings，PDs）［3］作為分析動物 MSC的自我更新能力的指標，PDs=lg（培養(yǎng)后細胞計數(shù)/培養(yǎng)前細胞計數(shù)）/lg2。各代PDs值累加即得最終的累積細胞群體 倍 增 值 （cumulative population doublings，CPDs）。

1.5 數(shù)據統(tǒng)計分析

采用SPSS16.0軟件，將2月齡和9月齡WT鼠和Terc-/-鼠MSC的傳代生長克隆數(shù)取均數(shù)，進行計量資料的T檢驗比較。

2 結果

2.1 MSC原代培養(yǎng)的生長特征

WT鼠MSC原代培養(yǎng)生長顯示，原代接種后的48 h開始從骨片遷出并貼壁，其后24 h可見大量細胞游出在骨片邊緣，貼壁生長細胞外形為紡錘型或梭形，3 d為MSC生長的潛伏期，此期主要為MSC的貼壁生長階段，培養(yǎng)細胞的有絲分裂活動不甚活躍；第4～6天開始，相差顯微鏡下可以觀察到貼壁細胞已形成大小不一的多個細胞克隆，說明此時細胞的有絲分裂活動開始變得活躍起來（圖1）；第7～8天這些細胞克隆進一步擴大，許多細胞克隆彼此相連，細胞生長曲線顯示此階段細胞數(shù)目呈指數(shù)級遞增，此期為MSC原代培養(yǎng)生長的對數(shù)增殖期；第9～11天，細胞克隆彼此相連并鋪滿整個培養(yǎng)孔底面的大部分，細胞生長曲線顯示MSC生長進入一個平臺期；隨后貼壁生長的MSC開始鋪滿整個培養(yǎng)孔底面，原代培養(yǎng)結束。通過比較2月齡和9月齡WT鼠和Terc-/-鼠 MSC的原代生長特征，Terc-/-鼠的MSC生長緩慢，形成克隆數(shù)量少，原代細胞形成克隆數(shù)為WT鼠＞Terc-/-鼠。

圖1 接種4 d后MSC形態(tài)鏡下觀察Fig.1 Morphology of MHCs observed by microscope

2.2 MSC傳代培養(yǎng)的生長特征

WT鼠MSC傳代培養(yǎng)多數(shù)于P9代以后開始出現(xiàn)衰老征象。傳代細胞的生長較原代要快些，多于接種后10 d即可鋪滿整個培養(yǎng)孔的底面。對2月齡和9月齡WT鼠和Terc-/-鼠傳代細胞培養(yǎng)觀察比較，以鏡下大于10個細胞的計為一個集落（圖2，P＜0.01）。傳代培養(yǎng)潛伏期約為24～36 h；傳代培養(yǎng)對數(shù)增殖期約為4～6 d；對數(shù)增殖期結束后至接種后第10天，MSC生長逐漸緩慢，進入平臺期。

2.3 MSC自我更新能力分析

隨著傳代培養(yǎng)代數(shù)的漸次增加，MSC的生長速度有逐漸緩慢的趨勢。傳代接種第5天后，Terc-/-鼠P4以后的MSC生長速度減緩明顯，至接種后第10天計算所得的MSC數(shù)目WT鼠＞Terc-/-鼠。三種不同基因型鼠各隨機抽取的3個樣本，傳代培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)衰老征象的情況分別是：WT鼠于P10，Terc-/-鼠于 P7，故統(tǒng)計 MSC的 PDs及 CPDs計算至P7。由圖3可見，從P1至P8每代MSC的

圖2 小鼠MSC的P2傳代細胞培養(yǎng)生長情況Fig.2 Culture status on passage 2 cells of MSC from mice

PDs值在P3達到高峰，而P7之后則僅為不足1，說明增殖能力減弱；WT鼠的CPDs值為10.4±1.1，明顯高于Terc-/-鼠，在P1至P7階段的體外培養(yǎng)分離中，MSC的有絲分裂活動旺盛，具有活躍的增殖倍增能力。

圖3 兩種小鼠MSC傳代培養(yǎng)的CPDL變化比較Fig.3 Cumulative population doublings＇difference between two type mice

3 討論

間充質干細胞多來自骨髓，也存在于其它器官和組織［4］，一定條件下MSC可以分化成多種組織，包括骨，脂肪和軟骨。MSC的功能除了促進造血和組織修復外，更多的應用在疾病治療方面，如骨骼缺損，糖尿病，急性移植排斥反應和類風濕關節(jié)炎等。為實現(xiàn)上述臨床應用研究，以小鼠為研究對象進行了大量的實驗研究，如何從小鼠提取足夠多的MSC成為關鍵。

小鼠 MSC分離培養(yǎng)方法起初由 Friedenstein等［5］建立，利用MSC具有能粘貼在塑料培養(yǎng)瓶的特性分離MSC，利用該方法從人類和大動物骨髓中分離獲得MSC比較成功，但在小鼠骨髓內獲得足夠多的MSC相對困難，因為小鼠的骨髓腔內MSC數(shù)量低，同時也存在造血細胞的污染。為了改進這這一方法，有研究嘗試使用磁珠分選、逆轉錄轉染和建立獨特培養(yǎng)體系等方法［6，7］，但是這些方法標準化困難，并且或多或少損傷細胞生物活性。

細胞生物學原理顯示細胞的數(shù)量及密度對其增生和分化會產生很大的影響，由于小鼠MSC在骨髓中所占的細胞比例少，因此設法改進在體外條件下提取純化更多MSC成為實驗的重點。本實驗以小鼠皮質骨微小骨片獲得鼠MSC的培養(yǎng)方法，獲得了大量的MSC，方法簡單且重復性好。相同的獲取MSC的方法見于人體松質骨骨片［8］。與從小鼠股骨骨髓腔獲得 MSC不同，本方法通過多次沖洗髓腔，力求徹底減少造血等細胞的污染，將皮質骨切成微小骨塊酶消化后置于培養(yǎng)液內，開始3 d內不需要換培養(yǎng)液，48 h可見骨片周圍有成纖維樣細胞，72 h可以觀察到克隆形成，優(yōu)于骨髓腔來源的MSC培養(yǎng)觀察。這種方法可以在較短時間內獲得大量（數(shù)量＞107）MSC細胞，并且培養(yǎng)過程中不需要額外添加細胞生長因子，渴望為今后實驗研究小鼠MSC提供比較好的技術支撐。

端粒是位于真核細胞染色體末端的帽狀結構，主要功能是穩(wěn)定染色體，保護DNA。正常細胞每分裂一次，端粒都會縮短。端?？s短限制了細胞的壽命，在衰老和慢性病過程中細胞的增殖能力下降，當端粒縮短到一定程度，染色體末端脫帽導致細胞衰老或凋亡。因為WT鼠的端粒長度是人類的五倍，所以建立3～6代以后的鼠，這時的端粒才會足夠短，表型也容易觀察［9］。通過建立觀察端粒酶基因敲除鼠 G3（Terc-/-鼠第三代）的表型，發(fā)現(xiàn)Terc-/-鼠存在造血功能、成骨能力以及消化系統(tǒng)的明顯衰老，骨骼器官的衰老主要原因可能來自MSC的功能異常，經過原代和傳代培養(yǎng)觀察，Terc-/-鼠MSC的增殖能力明顯低于WT鼠。通過對MSC連續(xù)傳代培養(yǎng)，結果顯示，Terc-/-鼠MSC在經歷了7代的傳代培養(yǎng)以后MSC出現(xiàn)衰老征象，即細胞增生速度緩慢，多數(shù)細胞出現(xiàn)核固縮、核碎裂及由培養(yǎng)孔底面脫落等，這與許多其他種類細胞的體外傳代培養(yǎng)的結局相似。因此有關這種衰老現(xiàn)象出現(xiàn)的機理有待于通過進一步實驗闡明。此外，與原代培養(yǎng)生長曲線相比，傳代細胞的生長潛伏期較短，每代鋪滿培養(yǎng)孔底面需要時間短于原代細胞，這種共性見于WT鼠和Terc-/-鼠。

組織發(fā)生生物學認為，MSC可以向所有的中胚層起源的組織細胞方向進行分化，這是涉及諸多機制和階段的復雜過程［10］。已有報道通過MSC來修復骨組織、關節(jié)軟骨組織的缺損大都建立在大動物基礎上，如兔，羊，犬等，這些大動物骨髓內的 MSC數(shù)量雖然較多，能滿足研究需要，但是面對日益復雜的疾病模型研究，大動物無法提供靈活而豐富的基因型，小鼠則具有這一優(yōu)勢，這無疑為MSC研究提供更佳選擇?，F(xiàn)在，我們成功建立小鼠的MSC體外分離培養(yǎng)方法，初步觀察對比 G3WT鼠和G3Terc-/-鼠的MSC生長和增殖特征，以此為基礎，為我們今后深入研究MSC的各項功能提供啟發(fā)和指導。

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［10］趙春華 主編.干細胞原理、技術與臨床.北京：化學工業(yè)出版社，2006.63-68.