趙燕凌，張 斌，宋國(guó)華，劉茂林，高繼平

（1.山西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)影像系，太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，太原 030001）

氟作為機(jī)體生命活動(dòng)所必需的微量元素之一，它廣泛存在于飲水、土壤、大氣和動(dòng)植物體內(nèi)，但機(jī)體長(zhǎng)期過(guò)量攝入可導(dǎo)致慢性氟中毒。氟對(duì)雄性生殖系統(tǒng)有毒性作用，可直接作用于睪丸、附睪、前列腺等，破壞其結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致生育能力的下降［1］。研究表明間質(zhì)細(xì)胞受損，線(xiàn)粒體和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的變化顯著，可能通過(guò)增強(qiáng)脂質(zhì)過(guò)氧化作用，抑制物質(zhì)和能量代謝過(guò)程，損傷DNA等途徑對(duì)雄性生殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能造成直接損害［2］。氟對(duì)雄性生殖系統(tǒng)的損害是多途徑、十分復(fù)雜的過(guò)程，關(guān)于氟致睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡作用和機(jī)制仍不十分清楚［3］。因此，氟對(duì)雄性生殖系統(tǒng)的影響日益受到重視。

本研究選用小鼠建立氟染毒模型，對(duì)氟染毒小鼠睪丸組織的結(jié)構(gòu)和組織凋亡進(jìn)行分析，觀察氟對(duì)小鼠睪丸組織病理學(xué)變化，用TUNEL技術(shù)檢測(cè)睪丸組織細(xì)胞凋亡，探討氟引起睪丸組織損傷和凋亡的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

動(dòng)物：健康雄性昆明小鼠40只，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（SCXK［晉］2009-001）。

試劑：氟化鈉（NaF，分析純，購(gòu)自天津化學(xué)試劑廠(chǎng)）；TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒（北京中昊生物公司）；4％多聚甲醛。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立

雄性昆明小鼠40只常規(guī)飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為四組：對(duì)照組、低氟組、中氟組和高氟組，每組10只。根據(jù)已發(fā)表文獻(xiàn)［4，5］對(duì)實(shí)驗(yàn)組給藥劑量和用藥時(shí)間稍作修改，對(duì)照組飼喂普通飼料，飲去離子水；低氟組、中氟組和高氟組飼喂普通飼料，分別飲用含10，25，50 mg/L氟化鈉去離子水。定時(shí)飼喂飼料，自由采食、飲水。環(huán)境溫度20～25℃。實(shí)驗(yàn)期間每天觀察動(dòng)物活動(dòng)、飲食、排泄、反應(yīng)及氟斑牙情況，同時(shí)每周稱(chēng)重1次，觀察體重變化。

1.2.2 標(biāo)本采集

飼喂120 d后，麻醉后解剖，迅速取其睪丸組織，生理鹽水沖洗，置于4％多聚甲醛固定液中固定24 h。

1.2.3 切片制作

睪丸組織在4％多聚甲醛中固定24 h后，自來(lái)水沖洗，去離子水沖洗，將睪丸組織用鋒利刀片沿縱向?qū)Π肭懈畛蓛蓧K，梯度酒精脫水，置二甲苯透明，較低溫度（低于60℃）下浸蠟，包埋。將包埋好的蠟塊置于石蠟切片機(jī)上切片，厚度為5μm。將切片漂浮于45℃溫水中，然后用0.01％多聚賴(lài)氨酸處理過(guò)的載玻片撈起，并放在烘片機(jī)上烤干。

1.2.4 HE染色

按常規(guī)方法對(duì)組織切片作HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察組織病理學(xué)變化。

二甲苯、酒精脫蠟至水→蘇木精染色10 min，鏡下控制鹽酸酒精分化，水洗返藍(lán)→脫水到90％酒精→伊紅5 min→梯度乙醇脫水（濃度：75％-80％-90％-100％）→二甲苯透明→中性樹(shù)膠封片→光鏡下觀察睪丸組織形態(tài)。

1.2.5 原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)

采用 TdT介導(dǎo)的末端標(biāo)記法（TdT-mediated dUTP nick end labelin，TUNEL法）進(jìn)行細(xì)胞凋亡的原位檢測(cè)，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。TUNEL結(jié)果計(jì)算：400倍高倍鏡下觀察，陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞核呈棕黃色，細(xì)胞核出現(xiàn)黃至棕褐色顆粒均為陽(yáng)性細(xì)胞，凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征為染色質(zhì)濃集、核裂解以及核周新月體樣濃集染色質(zhì)，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)深色凋亡小體者為凋亡細(xì)胞。隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野（400倍）并計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，記錄凋亡細(xì)胞數(shù)，計(jì)算凋亡指數(shù)（AI）：AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/500×100％。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±S）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床檢查

染毒期間，對(duì)照組小鼠營(yíng)養(yǎng)活動(dòng)狀況良好，皮膚有彈性，被毛濃密有光澤，反應(yīng)活躍機(jī)敏，活動(dòng)敏捷，對(duì)照組小鼠的體重隨染毒時(shí)間延長(zhǎng)呈正增長(zhǎng)。牙齒完整有光澤，釉質(zhì)棕黃色半透明。氟中毒組小鼠營(yíng)養(yǎng)狀況較差，身體瘦弱，被毛蓬亂無(wú)光澤，反應(yīng)遲鈍。下切齒失去光澤，牙釉質(zhì)出現(xiàn)白堊樣不透明性改變，表面粗糙，變脆易磨損，長(zhǎng)度為正常時(shí)的1/ 2，有的僅剩殘根。

2.2 病理剖檢

正常飼料對(duì)照組小鼠剖開(kāi)腹腔后，可見(jiàn)皮下脂肪充盈，肌肉豐滿(mǎn)，內(nèi)臟器官檢查未見(jiàn)異常。

染氟組小鼠剖開(kāi)腹腔后，可見(jiàn)皮下脂肪貧瘠，肌肉緊緊附著于骨，不易剝離，內(nèi)臟器官檢查見(jiàn)異常。

2.3 睪丸組織形態(tài)學(xué)的變化

實(shí)驗(yàn)觀察到正常組睪丸間質(zhì)細(xì)胞，周?chē)忻黠@較長(zhǎng)突起，胞體扁橢圓形，細(xì)胞核正常，核染色質(zhì)分布均勻，胞質(zhì)中細(xì)胞器分布正常。用光鏡觀察染氟組睪丸細(xì)胞，小鼠曲精小管退化壞死，可見(jiàn)細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞皺縮、體積縮?。话麧{結(jié)構(gòu)疏松內(nèi)有水腫空泡，細(xì)胞內(nèi)器稀少，胞體核固縮，核染色質(zhì)凝集呈塊狀分布，染色質(zhì)邊集，核周出現(xiàn)空泡樣變化；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹模糊不清（彩插3見(jiàn)圖1）。

2.4 睪丸組織凋亡檢測(cè)

顯微鏡鏡下觀察，凋亡細(xì)胞核特異性染色呈棕色，胞漿為淺棕色，非凋亡細(xì)胞為淺紫色（彩插3見(jiàn)圖2）。鏡下表現(xiàn)為細(xì)胞收縮變圓失去微絨毛，與鄰近細(xì)胞連接消失，核內(nèi)染色質(zhì)濃縮邊集，出現(xiàn)細(xì)胞膜內(nèi)陷分割，并有膜包裹的凋亡小體形，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞有的胞核略小，有的胞核呈碎片狀。氟中毒組引起大量TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞（彩插3見(jiàn)圖2）。與對(duì)照組比較，染氟組睪丸細(xì)胞凋亡率顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表1。

表1 小鼠睪丸細(xì)胞凋亡率的比較Tab.1 Comparison of testis apoptosis in mouse

3 討論

3.1 高氟對(duì)動(dòng)物組織的損傷

近年來(lái)氟化物對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)功能的影響引起廣泛的重視，研究表明氟化物可引起小鼠和大鼠睪丸、腎近曲小管、肝臟、大腦皮質(zhì)細(xì)胞的組織學(xué)改變以及激素水平的變化。有報(bào)道氟中毒對(duì)大鼠腎近曲小管上皮細(xì)胞有明顯的渾濁腫脹和空泡變性，并伴有少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，多數(shù)腎近曲小管管腔狹窄變形，局部出現(xiàn)壞死崩解。發(fā)現(xiàn)氟中毒能明顯誘導(dǎo)大鼠腎臟細(xì)胞凋亡，并存在壞死［6］。崔留欣等［7］關(guān)于氟致雄性大鼠生殖功能損害的實(shí)驗(yàn)研究表明，染氟組的各級(jí)生精細(xì)胞數(shù)量減少，結(jié)構(gòu)疏松，成熟精子的數(shù)量下降。郭曉英［8］關(guān)于氟對(duì)大鼠肝臟功能和形態(tài)的影響及與氧化應(yīng)激關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究表明，染氟組大鼠肝細(xì)胞細(xì)胞界限不清，細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)濃縮、邊集，呈半月形聚集于核膜下；線(xiàn)粒體可見(jiàn)明顯腫脹，蠟斷裂或消失；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張；可見(jiàn)較多的白色脂滴；毛細(xì)膽管擴(kuò)張，腔面微絨毛減少。不同日齡氟中毒三代大鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞凋亡程度增高，氟中毒可以引起世代蓄積，接觸氟環(huán)境時(shí)間越長(zhǎng)，其動(dòng)物子代大腦損傷越嚴(yán)重［9］。Schalz等［10］研究結(jié)果認(rèn)為氟可抑制小鼠血清睪酮水平，使其比對(duì)照組下降40％，氟化物毒性與動(dòng)物生殖力下降呈正相關(guān)。染毒組精子計(jì)數(shù)、活動(dòng)率下降，畸形率升高，血清睪酮、促黃體生成激素下降。

本研究結(jié)果及以往報(bào)道都表明，高氟會(huì)導(dǎo)致小鼠曲精小管退化壞死，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞皺縮、體積縮??；胞漿結(jié)構(gòu)疏松內(nèi)有水腫空泡，細(xì)胞內(nèi)器稀少，胞體核固縮，核染色質(zhì)凝集呈塊狀分布，染色質(zhì)邊集，核周出現(xiàn)空泡樣變化；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹模糊不清。關(guān)于高氟對(duì)生殖系統(tǒng)毒作用機(jī)制的分子和基因水平的研究還有待于進(jìn)一步探討。

3.2 染氟小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡

氟是一種原生質(zhì)毒物，可以誘導(dǎo)機(jī)體不同組織發(fā)生細(xì)胞凋亡。當(dāng)前，細(xì)胞凋亡已成為分子生物學(xué)、胚胎學(xué)、放射生物學(xué)、腫瘤學(xué)、免疫學(xué)和血液學(xué)的研究熱點(diǎn)。許多外界不良因素可以誘導(dǎo)機(jī)體組織的細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡是指在基因調(diào)控下的細(xì)胞自主死亡，細(xì)胞以這種主動(dòng)死亡來(lái)維持組織的自身穩(wěn)定。它在生物體的生長(zhǎng)發(fā)育、衰老、組織損傷與修復(fù)以及病毒感染中都發(fā)揮重要的作用。

氟為細(xì)胞毒性物質(zhì)，近年來(lái)細(xì)胞凋亡在氟中毒發(fā)病機(jī)制中的作用引起了人們的廣泛關(guān)注，人們已從多方面探討了氟化物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。已有研究表明，高氟對(duì)多種組織細(xì)胞的損傷不伴有炎癥反應(yīng)，而以核內(nèi)染色質(zhì)邊集、細(xì)胞萎縮的改變?yōu)樘卣?，此與眾多學(xué)者對(duì)細(xì)胞凋亡的描述相吻合［11］，提示細(xì)胞凋亡可能是氟致機(jī)體組織細(xì)胞損傷的重要參與因素。結(jié)構(gòu)改變是不可逆的，其損害的程度與體內(nèi)氟負(fù)荷密切相關(guān)。但氟究竟是如何引起睪丸病理改變、導(dǎo)致生殖功能損害目前不清楚。

TUNEL實(shí)際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確地反應(yīng)細(xì)胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征。細(xì)胞凋亡的生化特征之一，是Ca2+、Mg2+離子依賴(lài)的內(nèi)源性核酸酶的激活將核染色體從核小體間斷裂，形成由大約為180～200 bp或其多聚體組成的寡核苷酸片段，從而產(chǎn)生有游離粘性3＇-OH的DNA斷鏈，因此可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)，即脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（term inal-deoxynucleotidyl transferasemediated nick end labeling，TUNEL）。TUNEL法是目前唯一具有普遍意義且已發(fā)展成熟的檢測(cè)方法，可實(shí)現(xiàn)末端定量，并可在形態(tài)學(xué)改變之前檢測(cè)到凋亡，且敏感、標(biāo)記強(qiáng)度大［12］。根據(jù)實(shí)驗(yàn)原理，TUNEL法較免疫組化法更加精確、敏感，在時(shí)序性上早于免疫組化法表達(dá)出細(xì)胞凋亡的特性，故本實(shí)驗(yàn)考慮以TUNEL法的結(jié)果為準(zhǔn)，推測(cè)氟中毒后對(duì)睪丸組織功能有明顯影響。

在氟中毒與細(xì)胞凋亡關(guān)系的研究中，國(guó)外學(xué)者主要采用體外細(xì)胞培養(yǎng)的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，觀察到培養(yǎng)肺細(xì)胞經(jīng)氟化物處理后 DNA的損害和凋亡改變［13］。Lowth［14］給體外培養(yǎng)的胰島 β細(xì)胞染氟以后，電鏡下觀察到染色質(zhì)邊集及DNA降解成寡聚核甘酸，呈現(xiàn)出凋亡特征。Lonroy［15］用氟化鋁處理胸腺小葉時(shí)，亦激起大范圍胸腺細(xì)胞亞型的凋亡。Hirano［16］培養(yǎng)骨肉瘤細(xì)胞UMR106株，用5 mmol/L氟處理8 h以后，用TUNEL法證明了細(xì)胞凋亡的存在。國(guó)內(nèi)學(xué)者以大體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過(guò)量氟可誘導(dǎo)組織細(xì)胞凋亡。呂曉紅［17］在慢性氟中毒大鼠觀察到腦細(xì)胞中DAB著染陽(yáng)性的凋亡細(xì)胞，并且表達(dá)具有選擇性，流式細(xì)胞術(shù)顯示慢性氟中毒腦組織中的凋亡峰明顯高于正常對(duì)照組。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)同樣檢測(cè)到氟中毒大鼠和家兔肝細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組明顯增加［18，19］。實(shí)驗(yàn)中 TUNEL檢測(cè)結(jié)果顯示：顯微鏡鏡下觀察，對(duì)照組細(xì)胞核呈現(xiàn)出淡紫色，染毒組細(xì)胞核呈現(xiàn)出棕黃色，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞有的胞核略小，有的胞核呈碎片狀。氟中毒組引起大量TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，而對(duì)照組大鼠罕見(jiàn)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞。氟可促進(jìn)睪丸組織細(xì)胞的過(guò)度凋亡及引起細(xì)胞壞死，且細(xì)胞凋亡率比同劑量同時(shí)間組細(xì)胞壞死率高。這提示細(xì)胞過(guò)度凋亡可能是氟誘發(fā)的睪丸組織細(xì)胞損傷的主要形式，細(xì)胞壞死則是細(xì)胞凋亡晚期的表現(xiàn)。氟誘發(fā)睪丸組織細(xì)胞損傷，可解釋氟可能對(duì)睪丸毒作用的機(jī)制，即氟通過(guò)誘發(fā)睪丸組織細(xì)胞過(guò)度凋亡而對(duì)睪丸造成功能性或器質(zhì)性損害。這也印證了氟對(duì)睪丸早期功能性損害的可逆性及晚期結(jié)構(gòu)性改變的不可恢復(fù)性。

本研究用病理學(xué)觀察、TUNEL的凋亡檢測(cè)，證明了氟染毒可導(dǎo)致小鼠睪丸組織細(xì)胞凋亡，提示過(guò)量氟在體內(nèi)的毒性和細(xì)胞凋亡有關(guān)，本結(jié)果為深入研究氟的雄性生殖毒性提供了資料。高氟對(duì)睪丸組織的損害存在細(xì)胞凋亡，其損害過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，細(xì)胞凋亡還受到其他多種細(xì)胞凋亡基因的調(diào)控，如Caspase家族、一氧化氮、興奮性氨基酸、自由基等，各種因素在睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡的過(guò)程發(fā)揮怎樣的相互作用，還需開(kāi)展深入研究。

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