丁 峰 楊 夙 王 巍 孫宏治 白 光 (遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院普外科，遼寧 錦州 200)

姜黃素誘導(dǎo)人胃癌MGC-803細(xì)胞凋亡的機制

丁 峰 楊 夙1王 巍 孫宏治 白 光 (遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院普外科，遼寧 錦州 121001)

目的通過體外實驗探討姜黃素誘導(dǎo)人胃癌MGC-803細(xì)胞凋亡的作用機制。方法取人胃癌細(xì)胞系MGC-803培養(yǎng)至對數(shù)生長期，按姜黃素作用的不同濃度分組:3.12、6.25、12.5、25.0、50.0μmol/L，作用的不同時間分組:24、48、72 h，采用四甲基耦氮唑藍(lán)(MTT)計算細(xì)胞抑制率;應(yīng)用吖啶橙熒光染色觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期的變化;使用瓊脂糖凝膠電泳觀察細(xì)胞DNA片段化作用。結(jié)果(1)利用MTT比色分析法，發(fā)現(xiàn)MGC-803細(xì)胞分別用含不同濃度姜黃素溶液培養(yǎng)24、48、72 h后，細(xì)胞增殖受到明顯的抑制，且與濃度和時間呈正相關(guān);(2)通過吖啶橙染色發(fā)現(xiàn)，在姜黃素作用下，部分細(xì)胞明顯變圓，體積縮小，熒光增強，核染色質(zhì)固縮，呈新月形、腎形在核膜周邊聚集;(3)流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，姜黃素主要使細(xì)胞周期阻滯于S期，G1期細(xì)胞數(shù)減少，G2/M期細(xì)胞數(shù)變化不明顯;(4)DNA瓊脂糖凝膠電泳顯示，12.5、25.0、50.0μmol/L濃度處理組作用48 h后出現(xiàn)典型的DNA斷裂的梯子樣外觀。結(jié)論姜黃素能明顯抑制人胃癌細(xì)胞MGC-803的增殖并誘導(dǎo)凋亡，其作用機制可能與細(xì)胞的S期阻滯有關(guān)。

姜黃素;胃癌;凋亡;

姜黃素(Curcumin，Cur)是從姜科姜黃屬植物姜黃、郁金等植物的根莖中提取的一種天然有效成分，具有抗氧化、抗炎癥反應(yīng)、抗動脈粥樣硬化、降血脂等多種作用，對多種腫瘤具有明顯的生長抑制而無致突變作用，由于其獨特的作用機制且“高效低毒”的優(yōu)點，已成為近年來抗腫瘤藥物中最受重視的一類新藥〔1〕。本實驗旨在探討Cur對人胃癌細(xì)胞系MGC-803的增殖抑制作用以及作用的量效、時效關(guān)系，通過形態(tài)學(xué)、細(xì)胞周期的改變、活化蛋白的表達(dá)等相關(guān)指標(biāo)，研究其作用機制，從而為臨床使用Cur治療胃癌提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶(美國Gibco公司);糖酸酶(RNase)、碘化丙啶(PI)、100 bp DNA ladder和凝膠儲備液(華美生物試劑公司)。流式細(xì)胞儀:FACSCalibur，美國;數(shù)顯氣浴恒溫振蕩器:CHA-SA，江蘇;酶聯(lián)免疫檢測儀:DJ3022A，上海;Bio-rad半干轉(zhuǎn)印儀:德國。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人MGC-803細(xì)胞在完全培養(yǎng)基(RPMI-1640培養(yǎng)基90%體積分?jǐn)?shù)、胎牛血清10%、青霉素100 U/ml、鏈霉素100μg/ml)中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，0.25%胰蛋白酶消化至胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大時倒出胰蛋白酶，加入胎牛血清終止消化，離心，記數(shù)1×105/ml細(xì)胞密度。MTT法測細(xì)胞成長抑制率:取對數(shù)生長期的MGC-803細(xì)胞，消化、計數(shù)，調(diào)整密度為1×105/ml接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μl。每組分別設(shè)4個復(fù)孔，細(xì)胞貼壁生長24 h后，更換實驗用培養(yǎng)液。分別培養(yǎng)24、48、72 h，實驗組加入含不同濃度Cur的培養(yǎng)液，終濃度為3.12、6.25、12.5、25、50 μmol/L，對照組加入等量 RPMI-1640 培養(yǎng)液。酶聯(lián)免疫檢測儀測量吸光度(OD)值(以DMSO作空白對照調(diào)零)，與對照組比較，計算各組細(xì)胞生長抑制率。生長抑制率(%)=(1－實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.2 吖啶橙(AO)染色觀察 預(yù)先根據(jù)24孔培養(yǎng)板孔徑大小，將蓋玻片剪成所需的小蓋片，消毒后置于24孔培養(yǎng)板孔內(nèi)備用。取對數(shù)生長期的MGC-803細(xì)胞，消化、計數(shù)，調(diào)整密度為1×105/ml，接種于24孔培養(yǎng)板，每孔500μl進行單層蓋片培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，更換培養(yǎng)液。實驗組加入含不同濃度Cur的培養(yǎng)液。對照組加入等量RPMI-1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及顏色并照相。

1.2.3 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期變化 取對數(shù)生長期MGC-803細(xì)胞，消化、計數(shù)，調(diào)整密度為1×105/ml。6孔培養(yǎng)板每孔接種量2 ml，37℃培養(yǎng)24 h后更換實驗用培養(yǎng)液。實驗組加入含不同濃度Cur的培養(yǎng)液，作用24、48 h后分別終止培養(yǎng)，對照組加入等量RPMI-1640培養(yǎng)液。用流式細(xì)胞儀分析標(biāo)本，分析采用Nicolletri法。汞激發(fā)激光波長為488 nm，15 mV，分析軟件為 Cellquest和Modfit LI for Machitash V 3.0。

1.2.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期細(xì)胞，消化、計數(shù)，調(diào)整密度為1×105/ml。每個培養(yǎng)瓶接種量4 ml，37℃培養(yǎng)，24 h后更換實驗用培養(yǎng)液。實驗組加入含不同濃度Cur的培養(yǎng)液，作用于48 h后分別終止培養(yǎng)，對照組加入等量RPMI-1640培養(yǎng)液。收集以上細(xì)胞及對照組細(xì)胞，1 000 r/min，離心5 min，棄培養(yǎng)液，PBS洗兩次，棄上清;再加入1 ml PBS重懸細(xì)胞，移入1 m l微量離心管中1 000 r/min，離心5 min棄上清。加入50μl細(xì)胞裂解液，混勻，于37℃水浴恒溫至混合物變得清亮;在高速冷凍離心機中，室溫12 000 r/min，10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一潔凈的微量離心管中。以等體積的苯酚/氯仿(1∶1)，苯酚/氯仿/異丙醇(25∶24∶1)和氯仿各抽提一次;在上清中加入1/10體積3 mol/L醋酸鈉和2倍體積的冷乙醇，于－20℃沉淀過夜;在 －20℃，12 000 r/min離心10 min，收集并將沉淀溶入20μl TBE緩沖液，加入1μl RNA酶，37℃保溫1 h。加入4μl樣品緩沖液，混勻，立即加到含有0.4μg/ml溴化乙錠的1% ～2% 瓊脂糖凝膠的樣品中，室溫，于1倍TBE緩沖液中5 V/cm電壓下電泳1～2 h，紫外分析儀觀察實驗結(jié)果并拍照。以標(biāo)準(zhǔn)品100 bp DNA ladder為對照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS11.0軟件，計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 MTT實驗結(jié)果 不同濃度的Cur(3.12、6.25、12.5、25.0、50.0μmol/L)處理細(xì)胞24、48、72 h后對照組與實驗組不同濃度的Cur不同時點對MGC-803的抑制率見表1。各組細(xì)胞形態(tài)變化見圖1。鏡下可見對照組細(xì)胞貼壁生長緊密，生長情況良好，細(xì)胞呈梭形或多邊形，細(xì)胞透明，折光性好，狀況佳。中等劑量組(12.5μmol/L)細(xì)胞形態(tài)欠規(guī)則，細(xì)胞間隙增大，胞漿內(nèi)變化不明顯或略有變化，死亡細(xì)胞增多。大劑量組(50.0μmol/L)細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，大部分細(xì)胞漂浮于細(xì)胞培養(yǎng)液中，并可看到壞死細(xì)胞和碎片，有的細(xì)胞內(nèi)可看到黑色顆粒物質(zhì)。

2.2 AO染色實驗 活細(xì)胞經(jīng)過AO染色以后，在電子熒光顯微鏡下細(xì)胞的形態(tài)不發(fā)生改變，細(xì)胞核DNA為黃色或黃綠色均勻發(fā)光，細(xì)胞質(zhì)為橘黃色或橘紅色熒光。當(dāng)出現(xiàn)凋亡細(xì)胞時，會出現(xiàn)明顯變化。實驗組與對照組均在電子熒光顯微鏡下經(jīng)BV濾片激發(fā)，可觀察到對照組細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞核圓型，核DNA呈現(xiàn)黃色或黃綠色均質(zhì)熒光，胞漿為橘黃色均質(zhì)熒光;實驗組出現(xiàn)凋亡細(xì)胞，表現(xiàn)為細(xì)胞體積縮小、變圓，核仁內(nèi)出現(xiàn)黃綠色碎片，細(xì)胞核呈新月形或腎型。見圖2。

表1 不同濃度的Cur在不同時間對MGC-803的抑制率(n=4，±s，%)

表1 不同濃度的Cur在不同時間對MGC-803的抑制率(n=4，±s，%)

與對照組比較:1)P﹤0.01;不同時間組之間比較:2)P﹤0.01;實驗組內(nèi)兩兩比較:3)P﹤0.01

組別 劑量(μmol/L)24 h 48 h 72 h對照組0 0.407±1.47 1.055±1.93 1.231±1.39實驗組 3.12 8.181±1.171)2)3)14.26±2.221)2)3)20.73±2.191)2)3)6.25 11.23±2.431)2)3)21.66±3.641)2)3)34.68±3.431)2)3)12.5 23.38±1.971)2)3)35.02±3.271)2)3)41.55±2.771)2)3)25.0 36.43±3.111)2)3)48.23±3.121)2)3)51.53±3.521)2)3)50.0 44.03±2.281)2)3)53.66±1.781)2)3)60.36±3.251)2)3)

圖1 各組細(xì)胞的形態(tài)變化

2.3 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期變化 對照組和不同濃度Cur組(12.5、25.0、50.0 μmol/L)作用細(xì)胞 24 h，細(xì)胞周期出現(xiàn)顯著變化，G0/G1期細(xì)胞數(shù)由80.37%降低到42.62%，S期由7.36%升高到37.43%，而G2/M期變化不明顯;隨著藥物作用濃度的增加，G0/G1期細(xì)胞數(shù)逐漸減少，S期細(xì)胞數(shù)逐漸增加，各濃度細(xì)胞數(shù)與對照組比較都有顯著差異(P＜0.05)，不同濃度間比較也具有顯著性差異。見表2，表3。

圖2 各組細(xì)胞凋亡情況

表2 不同濃度Cur作用24 h細(xì)胞周期的變化(n=3，±s，%)

表2 不同濃度Cur作用24 h細(xì)胞周期的變化(n=3，±s，%)

與對照組比較:1)P﹤0.05;實驗組內(nèi)兩兩比較:2)P﹤0.05;下表同

組別 劑量(μmol/L)G0/G1期 S期 G2/M期對照組0 80.37±1.69 7.36±1.17 19.19±1.37實驗組 12.5 64.24±2.121)2) 16.37±1.621)2) 20.39±1.031)2)25.0 54.36±1.041)2) 23.36±1.891)2) 22.01±2.021)2)50.0 42.62±1.111)2) 37.43±1.061)2) 19.95±1.221)2)

表3 不同濃度Cur作用48 h細(xì)胞周期的變化(n=3，±s，%)

表3 不同濃度Cur作用48 h細(xì)胞周期的變化(n=3，±s，%)

組別 劑量(μmol/L)G0/G1期 S期 G2/M期對照組0 73.29±2.21 8.52±2.04 18.46±1.62實驗組 12.5 60.37±2.121)2) 18.37±1.651)2) 21.26±1.141)2)25.0 51.22±1.271)2) 28.24±2.021)2) 20.54±1.311)2)50.0 38.23±2.011)2) 44.46±1.691)2) 17.31±2.231)2)

2.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測細(xì)胞凋亡 見圖3。不同濃度的Cur(12.5、25.0、50.0 μmol/L)作用MGC-803 細(xì)胞48 h，在 DNA電泳圖上可以看到典型的“梯子”形條帶，隨著作用藥物濃度增加，條帶逐漸清晰;對照組停留在加樣孔附近，呈單一條帶。

圖3 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

3 討論

胃癌是源自胃黏膜上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，占胃惡性腫瘤的95%，在我國發(fā)病率很高，死亡率占惡性腫瘤的第一位。因其臨床起病隱匿、發(fā)展迅速，確診時多屬晚期，手術(shù)切除率僅為20% ～30%左右;而且，術(shù)后有2/3以上臨床復(fù)發(fā)，大多數(shù)還有轉(zhuǎn)移。近年來，隨著對腫瘤生物學(xué)特性認(rèn)識的提高及化療新藥的不斷推出，國內(nèi)外關(guān)于化療的研究越來越多，化療作為腫瘤綜合治療的重要輔助手段日益受到關(guān)注，人們希望通過全身治療來消滅局部殘留的腫瘤細(xì)胞及微小轉(zhuǎn)移病灶，以治愈或延長患者的生存期。因此，化療被認(rèn)為是胃癌輔助治療的重要手段之一〔1〕。

細(xì)胞凋亡(apoptosis)又稱細(xì)胞程序性死亡(PCD)，是由基因調(diào)控的細(xì)胞自主的有序性死亡，其生理功能在于保持組織器官中正常細(xì)胞增殖和死亡數(shù)量的動態(tài)平衡。其通過激活細(xì)胞自身的“死亡裝置”而啟動、執(zhí)行，所謂“死亡裝置”就是指細(xì)胞內(nèi)專門負(fù)責(zé)細(xì)胞凋亡信號的感應(yīng)、調(diào)控、執(zhí)行的一整套分子程序。傳統(tǒng)的腫瘤治療觀念是藥物直接作用于核酸、微管蛋白和其他靶點來殺傷腫瘤細(xì)胞，隨著對凋亡研究的逐步深入，人們逐漸認(rèn)識到藥物除通過各自的靶點直接作用外，也可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來殺傷腫瘤細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞凋亡敏感性可能是影響化療效果的關(guān)鍵因素，因此，能否誘導(dǎo)凋亡已成為篩選抗癌藥物的標(biāo)準(zhǔn)之一，如何誘導(dǎo)凋亡也成為新的研究目標(biāo)〔2〕。

Cur是最近幾年被發(fā)現(xiàn)的具有抗腫瘤作用的一種植物單體，研究表明Cur在體外對多種腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制作用，在體內(nèi)實驗中也顯示有較好的抑制作用，體內(nèi)與體外實驗結(jié)果具有一定的相關(guān)性〔3〕。也有文獻(xiàn)報道，Cur可顯著抑制腫瘤細(xì)胞拓?fù)洚悩?gòu)酶 I的活性〔4，5〕。沃興德等〔6，7〕以人口服劑量的600倍做一次性最大耐受量實驗，所觀察各項指標(biāo)均正常，未看到1只小鼠死亡，證明Cur無明顯的急性毒性作用。腫瘤細(xì)胞的無限制快速增殖是其重要特征之一，抑制腫瘤細(xì)胞增殖是控制腫瘤的一條途徑。近年來研究發(fā)現(xiàn)Cur在體內(nèi)、外具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。Khafif等〔8〕報道Cur在體內(nèi)對小鼠肝癌H22、裸鼠移植人OS-732、HCT-8也顯示出較好的抑制作用，并且隨藥物濃度增大抑制率逐漸增大，呈量效依賴關(guān)系。Fujiki等〔9〕的研究也證實了Cur有顯著的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，并認(rèn)為Cur的抗腫瘤作用與刺激TNF-α的釋放有關(guān)。

本實驗證明，Cur可以顯著抑制MGC-803細(xì)胞的增殖，增殖抑制作用呈時間-濃度依賴關(guān)系，與文獻(xiàn)〔10〕報道一致。本實驗中所取最大作用濃度為50.0μmol/L，因此對于是否隨著藥物濃度的繼續(xù)增加，其抑制作用更加顯著尚不能肯定，需要在以后的相關(guān)實驗中加以證實。

細(xì)胞周期又稱細(xì)胞增殖周期，包括G1、S、G2、M期。所有增殖細(xì)胞均經(jīng)過同一類似周期，腫瘤細(xì)胞的增殖過程同樣要經(jīng)過分裂的各個時期。細(xì)胞周期正常與否與細(xì)胞的生長、分化、衰老和癌變密切相關(guān)。Lin等〔11〕認(rèn)為，腫瘤發(fā)生的根本原因在于基因組不穩(wěn)定，使本來應(yīng)停止增殖的或生理性凋亡的細(xì)胞不停地進入細(xì)胞周期，因而造成惡性增生。目前很多學(xué)者發(fā)現(xiàn)許多抗腫瘤藥物能夠影響腫瘤的細(xì)胞周期分布，任何一個時相的生物合成被阻斷，都可以使整個增殖周期被中斷。Lowe等〔12〕體外對肝癌細(xì)胞MKN-28研究報道，Cur可使其阻滯于S期，并可誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。Hecht等〔13〕通過流式細(xì)胞技術(shù)分析Cur對宮頸癌細(xì)胞HeLa的影響，結(jié)果顯示Cur阻滯宮頸癌HeLa細(xì)胞于S期，阻止腫瘤細(xì)胞向G2期發(fā)展，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

AO染色實驗結(jié)果顯示，Cur主要阻滯胃癌細(xì)胞MGC-803于S期;S期正是DNA合成時期，說明Cur可能有干擾腫瘤細(xì)胞核酸合成作用。根據(jù)Hecht的報道Cur有特異性抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶I的作用，所以推測抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶I的作用進而干擾核酸合成可能是Cur抑制腫瘤細(xì)胞于S期的機制之一。但其確切的機制尚未完全闡明，有待進一步深入研究。

瓊脂糖凝膠電泳是鑒定細(xì)胞凋亡生物化學(xué)指標(biāo)中最具特征性的手段之一，尤其適用于體外培養(yǎng)的均一細(xì)胞系〔14〕。細(xì)胞凋亡時染色體斷裂形成大約180～200 bp或其多聚體組成的寡核苷酸片段，瓊脂糖凝膠電泳就是將這些DNA片段從細(xì)胞中提取出來，紫外燈下觀察可見特征性的“梯狀”帶。而壞死細(xì)胞DNA的降解是隨機的，電泳所見為類似血涂片的連續(xù)性改變(diffuse smear)〔15〕。正常細(xì)胞則無 DNA降解，分子量大，走行緩慢，故表現(xiàn)為停留在加樣孔附近的單一條帶。本次實驗中就是把Cur作用48 h后實驗組與空白對照組細(xì)胞上機檢測，空白對照組停留在加樣孔附近，呈單一的條帶，說明對照組細(xì)胞無DNA的降解;實驗組則可以看到“梯子”樣條帶，并隨著藥物作用濃度的增加條帶變寬、變亮，大小為100 bp及其整數(shù)倍，說明在該處理因素下發(fā)生凋亡，且與藥物作用濃度正相關(guān)。

綜上所述，本實驗證明Cur能明顯抑制體外培養(yǎng)的MGC-803細(xì)胞的生長、增殖，并呈時間-劑量依賴關(guān)系;Cur的抗增殖作用主要是通過將MGC-803細(xì)胞阻滯于S期和誘導(dǎo)其凋亡來實現(xiàn)的，且細(xì)胞凋亡與S期的阻滯關(guān)系密切。

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R735.2

A

1005-9202(2012)12-2549-04;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.12.048

遼寧省科技廳科學(xué)計劃項目(No.2010225034)

1 遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院消化內(nèi)科

白 光(1960-)，男，主任醫(yī)師，教授，主要從事肝膽疾病基礎(chǔ)與臨床研究。

丁 峰(1981-)，男，碩士，醫(yī)師，主要從事肝膽疾病基礎(chǔ)與臨床研究。

〔2011-10-15收稿 2012-01-27修回〕

(編輯 袁左鳴)