蔡 哲 石 超 范林洋 李曉陽 楊春蕾

(四川大學(xué)生命科學(xué)院醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教研室，四川 成都 610041)

MORF4基因誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞衰老

蔡 哲 石 超 范林洋 李曉陽 楊春蕾

(四川大學(xué)生命科學(xué)院醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教研室，四川 成都 610041)

目的建立MORF4基因高表達(dá)誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞衰老模型，探索MORF4基因?qū)eLa細(xì)胞衰老的影響。方法分別將pcDNA3.1(+)/Flag-MORF4和pcDNA3.1(+)空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人宮頸癌HeLa細(xì)胞株。SA-β-Gal染色檢測細(xì)胞衰老，MTT法及流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期變化及細(xì)胞的增殖活力，兩者共同確定MG-132處理的最適條件。Western印跡檢測MORF4、PCNA基因的表達(dá)。結(jié)果質(zhì)粒經(jīng)酶切和測序鑒定，證明pcDNA3.1(+)/Flag-MORF4 質(zhì)粒中含有目的基因序列;經(jīng)濃度梯度1.25、2.5、5、10 μmol/LMG-132 處理轉(zhuǎn)染細(xì)胞2、4、24、48 h 后，SA-β-Gal染色和MTT檢測結(jié)果顯示10μmol/L MG-132處理24 h的轉(zhuǎn)染細(xì)胞明顯衰老，細(xì)胞活力降低;細(xì)胞周期被阻滯在G0/G1期，S期細(xì)胞明顯減少，增殖受到抑制;Western印跡檢測結(jié)果顯示MORF4蛋白在細(xì)胞中的含量明顯升高，而與增殖相關(guān)基因PCNA表達(dá)下調(diào)。結(jié)論構(gòu)建的pcDNA3.1(+)/Flag-MORF4質(zhì)粒在HeLa細(xì)胞中表達(dá);并在MG-132作用下，使MORF4基因的表達(dá)產(chǎn)物積累，從而影響PCNA蛋白的表達(dá)量，抑制HeLa細(xì)胞的增殖活性，阻滯細(xì)胞周期的進(jìn)行，導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入衰老狀態(tài)。

細(xì)胞衰老;MORF4基因;PCNA;細(xì)胞增殖

癌基因突變誘導(dǎo)的衰老與腫瘤的發(fā)生有著密切的關(guān)系，是避免細(xì)胞向腫瘤轉(zhuǎn)化的一種安全保護(hù)過程〔1〕。MORF4結(jié)構(gòu)與MRG家族基因MRG15和MRGX非常相似，含有多個類似轉(zhuǎn)錄因子的模序，可能具有轉(zhuǎn)錄性調(diào)控因子功能，對衰老或細(xì)胞生長調(diào)節(jié)起重要作用〔2，3〕。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老是一種抵抗腫瘤形成的保護(hù)性機(jī)制。由于當(dāng)前對MORF4基因的研究尚處在初級階段，對其誘導(dǎo)衰老的機(jī)制還不清楚。

1 材料與方法

1.1 實驗細(xì)胞 人宮頸癌細(xì)胞株HeLa由本教研室保存。實驗細(xì)胞分為:MORF4組為轉(zhuǎn)染目的基因細(xì)胞，NC組為轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒細(xì)胞，對照組為正常HeLa細(xì)胞。

1.2 藥品及試劑 LipofectamineTM2000試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品;胰蛋白酶、HEPES和MTT為Sigma公司產(chǎn)品;胎牛血清購于元亨金馬公司;MORF4抗體為Abcam公司產(chǎn)品，PCNA抗體購于武漢博士德，β-actin、GAPDH抗體購于Invitrogen公司;山羊抗兔，山羊抗小鼠二抗購于北京中杉金橋公司。

1.3 方法

1.3.1 雙酶切電泳和目的基因片段MORF4的序列檢測 通過BamH1和Xba1雙酶切質(zhì)粒目的基因片段，電泳檢測結(jié)果。質(zhì)粒中目的基因MORF4送北京華大基因公司測序。測序結(jié)果在NCBIGene數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)中的MORF4基因序列(NW_001838921.1)進(jìn)行比對。

1.3.2 HeLa細(xì)胞的G418穩(wěn)定篩選濃度的確定 接種HeLa細(xì)胞以105個/孔的密度于24孔板中，每孔的G418濃度依次為 100、200、300、400、500、600、700、800、900 和 1 000 μg/ml，篩選培養(yǎng)12～14 d，以確定穩(wěn)定篩選細(xì)胞的G418最適濃度和維持濃度。

1.3.3 轉(zhuǎn)染人宮頸癌細(xì)胞HeLa得到穩(wěn)定克隆 將HeLa細(xì)胞接種于24孔板中，每孔于500μl培養(yǎng)基中植入1×105個細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞的貼壁率達(dá)到90% ～95%時，以質(zhì)粒DNA(μg)和LipofectamineTM2000(μl)比例1∶3進(jìn)行轉(zhuǎn)染。48 h后以篩選濃度G418進(jìn)行篩選，2 w后挑取陽性克隆細(xì)胞并植入培養(yǎng)瓶中，在維持濃度G418培養(yǎng)液中維持培養(yǎng)。

1.3.4 檢測指標(biāo) MTT法檢測細(xì)胞活力;β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色檢測細(xì)胞衰老;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期的變化。Western印跡檢測MORF4及其相關(guān)基因的表達(dá)，經(jīng)ECL化學(xué)發(fā)光劑處理，Bio-Rad凝膠系統(tǒng)成像，Quantity one 4.6.2軟件進(jìn)行光密度分析。以上每組實驗均重復(fù)三次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 雙酶切電泳和目的基因片段MORF4的序列檢測 pcDNA3.1(+)/Flag-MORF4和pcDNA3.1(+)空載質(zhì)粒由美國德克薩斯州立大學(xué)Dr.Kaoru Tominaga饋贈。兩組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和XbaⅠ酶切后電泳得到兩條明顯的條帶。北京華大基因公司測序鑒定結(jié)果與NCBIGene bank中所找到的MORF4基因序列一致。見圖1。

圖1 pcDNA3.1(+)/Flag-MORF4和pcDNA3.1(+)空載質(zhì)粒載體雙酶切電泳圖

2.2 MORF4基因轉(zhuǎn)染結(jié)果檢驗 由Western印跡檢測轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)/Flag-MORF4和pcDNA3.1(+)空載質(zhì)粒細(xì)胞中蛋白表達(dá)量情況;證明轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后，MG-132最適處理條件下，MORF4蛋白表達(dá)量較對照組和NC組明顯升高。見圖2。

2.3 人宮頸癌細(xì)胞HeLa的G418穩(wěn)定篩選濃度和維持濃度經(jīng)G418濃度梯度篩選實驗確定其篩選濃度和維持濃度分別為600和300 μg/ml。

2.4 MTT法檢測細(xì)胞活力確定最適濃度和時間 MTT法分別確定MG-132處理的最佳時間和濃度。首先，經(jīng)不同濃度的MG-132處理后，得到不同時間的MTT吸光值，見表1、表2。實驗細(xì)胞經(jīng)10μmol/LMG-132處理后，比較MORF4組與NC組和對照組結(jié)果顯示:MORF4組MTT吸光值下降趨勢極其顯著，說明細(xì)胞活力顯著降低(P＜0.05);且24 h處理的實驗組細(xì)胞活力較未處理組明顯降低(P＜0.01)。故MG-132處理的最適反應(yīng)時間為24 h，最適反應(yīng)濃度為10μmol/L。

表1 MTT檢測MG-132濃度梯度處理細(xì)胞24 h后A570 nm的光吸收值(±s，n=3)

表1 MTT檢測MG-132濃度梯度處理細(xì)胞24 h后A570 nm的光吸收值(±s，n=3)

與對照組和NC組比較:1)P＜0.05

濃度(μmol/L) 對照組 NC組 MORF4組對照組2.34±0.12 2.34±0.00 2.36±0.19 1.25 2.29±0.19 2.15±0.00 2.17±0.33 2.5 2.38±0.00 2.34±0.10 2.22±0.15 5 2.22±0.26 2.22±0.16 2.15±0.23 10 2.19±0.03 2.23±0.08 1.90±0.131)

圖2 pcDNA3.1(+)/Flag-MORF4和pcDNA3.1(+)空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后MORF4蛋白表達(dá)

圖3 10 μmol/L MG-132處理2 h SA-β-Gal(×400)

圖4 10μmol/L MG-132處理24 h后的SA-β-Gal染色結(jié)果( ×400)

2.5 SA-β-Gal染色檢測細(xì)胞衰老 如圖3，圖4所示，經(jīng)10μmol/LMG-132處理2 h后，MORF4組和NC組與對照組相比(32.3% ±1.1%，27.6% ±1.2%，3.3% ±1.1%)，SA-β-Gal染色陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。而經(jīng)10μmol/LMG-132處理24 h后，MORF4組與2 h處理組比較，可以看到MORF4組的SA-β-Gal染色陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，衰老細(xì)胞核變大、出現(xiàn)小泡結(jié)構(gòu)，細(xì)胞呈現(xiàn)衰老樣表型。而與對照組(3.1% ±1.1%)相比陽性率達(dá)(63.4±1.1)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 MTT檢測光吸收值(A570 nm)確定最佳時間(±s，n=3)

表2 MTT檢測光吸收值(A570 nm)確定最佳時間(±s，n=3)

與未處理組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

時間(h)未處理組對照組 NC組 MORF4組10μmol/LMG-132處理組對照組 NC組 MORF4組0.70±0.14 4 1.49±0.28 0.92±0.25 0.73±0.17 1.49±0.08 1.35±0.25 0.72±0.10 24 1.58±0.02 0.63±0.07 0.42±0.04 1.09±0.042) 0.51±0.04 0.26±0.022)48 1.73±0.08 0.80±0.06 0.56±0.07 1.22±0.152) 0.47±0.032) 0.30±0.062)2 1.48±0.13 1.16±0.21 0.79±0.10 0.99±0.142) 0.80±0.031)

2.6 細(xì)胞周期的變化 選取10μmol/L MG-132處理24 h的MORF4組細(xì)胞與對照組細(xì)胞比較;經(jīng)流式細(xì)胞儀分析，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期時相分布發(fā)生變化:處于G0/G1期的細(xì)胞比例明顯增加(61.9% ±1.2%，52.1% ±1.0%)，而處于S期的細(xì)胞比例明顯減少(31.4% ±1.2%，45.0% ±1.0%)(P＜0.05)。

2.7 Western印跡檢測細(xì)胞衰老及增殖相關(guān)基因PCNA的表達(dá) 經(jīng)10μmol/LMG-132處理24 h后MORF4組與對照組比較，MORF4蛋白的累積量增加，表明在最適條件下轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中MORF4蛋白的累積得到促進(jìn)。PCNA表達(dá)量下降，細(xì)胞增殖能力受到抑制。如圖5所示，結(jié)果經(jīng)Quantity one 4.6.2軟件光密度分析，差異具有顯著性(P＜0.05)。

圖5 經(jīng)10μmol/L MG-132處理24 h后的SA-β-Gal染色結(jié)果( ×400)

3 討論

在對腫瘤和衰老的關(guān)系研究中，人們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的衰老可能成為腫瘤形成的天然屏障。細(xì)胞除了可以通過凋亡或自殺來抑制腫瘤形成外，還可以通過衰老阻止細(xì)胞分裂，進(jìn)而抑制腫瘤。腫瘤的發(fā)生與機(jī)體的衰老密切相關(guān)，并隨著年齡的增長而增加，這與機(jī)體內(nèi)在抗癌機(jī)制有關(guān)，其中DNA修復(fù)機(jī)制起著首要的作用，一旦修復(fù)失敗將導(dǎo)致細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞衰老，研究證實細(xì)胞衰老是腫瘤發(fā)生過程中一道重要的防線。

據(jù)Tominaga等〔4〕報道:MORF4基因在正常HeLa細(xì)胞中表達(dá)量很低且MORF4蛋白不穩(wěn)定，極易受到細(xì)胞內(nèi)泛素途徑快速降解，因而不易引發(fā)細(xì)胞衰老過程。我們將MORF4基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HeLa細(xì)胞中;通過添加泛素抑制劑MG-132，從而抑制MORF4蛋白的降解，而導(dǎo)致其在胞內(nèi)的積累;并發(fā)揮其誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的作用。Western印跡實驗結(jié)果也證實MORF4基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中經(jīng)MG-132處理后，DNA合成逐步衰減，細(xì)胞的增殖活力也受到明顯抑制，細(xì)胞代謝能力降低，生長受到抑制，表現(xiàn)衰老的特征。

PCNA是細(xì)胞DNA合成必需的物質(zhì)，它與細(xì)胞增殖關(guān)系密切，可評價細(xì)胞增殖狀態(tài)，目前認(rèn)為PCNA可以代表腫瘤細(xì)胞增殖能力。本實驗結(jié)果說明在MORF4蛋白累積的作用下腫瘤細(xì)胞增殖能力受到抑制。

綜上，本文結(jié)果證實MORF4基因在宮頸癌細(xì)胞中誘導(dǎo)衰老的重要作用。目前，基因靶向療法正逐步被采用，MORF4基因則可作為一個治療的靶點(diǎn)，本研究為癌癥的基因治療提供了實驗依據(jù)。本實驗所探討的在HeLa細(xì)胞中高表達(dá)MORF4基因的最適條件，可為后續(xù)的實驗探索癌細(xì)胞增殖抑制的分子機(jī)制提供有力的實驗支持。

1 Campisi J.Senescent cells，tumor suppression，and organismal aging:good citizens，bad neighbors〔J〕.Cell，2005;120:513-22.

2 Krtolica A，Parrinello S，Lockrtt S，et al.Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis:a link between cancer and aging〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2001;98(21):12072-7.

3 范軍強(qiáng)，趙勇剛，范 波，等.蛋白酶體抑制劑MG-132對體外人U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響〔J〕.河南科技大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2009;9(3):161-3.

4 Tominaga K，Tominaga E，Ausserlechner MJ，etal.The cell senescence inducing gene product MORF4 is regulated by degradation via the ubiquitin/proteasome pathway〔J〕.Exp Cell Res，2010;316(1):92-102.

The research on MORF4 gene induced senescence in HeLa cells

CAIZhe，SHIChao，F(xiàn)AN Lin-Yang，et al.
M edicine-Biology Laboratory of Life Science College of Sichuan University，Chengdu 610041，Sichuan，China

ObjectiveTo investigate the effects of MORF4 gene on HeLa cell senescence by establishing MORF4 gene overexpression model in HeLa cells.MethodspcDNA3.1(+)/Flag-MORF4 and pcDNA3.1(+)empty plasmid were transfected into HeLa cell line respectively.SA-β-Gal stainingwas used to test the cellular senescence and MTT assay and flow cytometry were used to detect the cell proliferation activity and changes of cell cycle.Resultsof SA-β-Gal staining and MTT assay were taken together to determine the optimum processing conditions ofMG-132.Western blotwas used to detected the expression ofMORF4 and PCNA gene.ResultsRestriction enzyme digestion and sequencing verified the target gene sequences.By the concentration gradient treatment of 1.25，2.5，5，10 μmol/LMG-132 after 2，4，24，48 h respectively in transfected HeLa cells，the results of SA-β-Gal staining and MTT assay showed that the transfected cellswere aging and cell viability was reduced after 10μmol/LMG-132 treatments for 24 h.Cell cycle was arrested in G0/G1phase.S phase cells were decreased significantly and cell proliferation was inhibited.The results ofWestern blot showed MORF4 proteins were significantly increased in the treated cells，while the expression of PCNA，proliferation-related genes，was down-regulated.ConclusionsConstructed pcDNA3.1(+)/Flag-MORF4 plasmid expressed in HeLa cells，effected by MG-132，caused the accumulation of MORF4 gene products，so that affecting the cell cycle-correlated protein PCNA levels.Therefore，MORF4 protein could inhibit cell proliferation，block cell cycle in HeLa cells，and finally lead to cells into the aging state.

Cell senescence;MORF4 gene;PCNA;Cell proliferation

R734.2

A

1005-9202(2012)12-2544-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.12.046

四川省科技廳項目(2011SZ0116)

楊春蕾(1964-)，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤生物學(xué)研究。

蔡 哲(1986-)，男，碩士，主要從事腫瘤細(xì)胞衰老研究。

〔2011-09-29收稿 2011-12-20修回〕

(編輯 曹夢園)