鐘小明 胡偵明 沈皆亮 甘 強 郝 杰 (重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院骨科，重慶 400016)

白藜蘆醇激活IGF-1R/AKT通路對退變椎間盤終板軟骨細胞合成細胞外基質的影響及其機制

鐘小明 胡偵明 沈皆亮 甘 強 郝 杰 (重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院骨科，重慶 400016)

目的探討白藜蘆醇對椎間盤軟骨終板細胞合成細胞外基質的影響及其機制。方法椎間盤軟骨終板細胞培養(yǎng)，傳代，P2代細胞培養(yǎng)48 h后，隨機分為5組，各組加入對應試劑培養(yǎng)12 h后終止培養(yǎng)，檢測胰島素樣生長因子(IGF)-1R、p IGF-1R、蛋白激酶B(AKT)、pAKT、Ⅱ型膠原(COLAⅡ)、aggrecan的表達變化。結果白藜蘆醇干預后IGF-1R及AKT磷酸化水平顯著增加，COLAⅡ、aggrecan基因轉錄水平上調，COLAⅡ、aggrecan合成增加;加入AG1024及SH-5抑制了IGF-1R及AKT磷酸化激活，COLAⅡ、aggrecan基因轉錄水平下降，COLAⅡ、aggrecan合成減少。結論

白藜蘆醇可促進退變椎間盤軟骨終板細胞合成細胞外基質COLAⅡ、aggrecan，抑制軟骨終板退變，其機制與激活IGF-1R/AKT信號通路有關。

白藜蘆醇;胰島素樣生長因子1受體;IGF-1R;蛋白激酶B;磷酸化;軟骨終板細胞;細胞外基質

白藜蘆醇(RES)是廣泛存在于葡萄酒、水果、中藥中的一種植物抗毒素和抗氧化劑，能夠發(fā)揮保護機體、抵抗各種應激及炎癥反應的作用。目前，尚缺乏RES對椎間盤細胞抑制退變方面的研究。我們的前期研究表明RES能夠通過促進椎間盤終板軟骨細胞特異性細胞外基質成分(2型膠原和aggrecan)的表達，但關于其機制目前并無相關報道。胰島素樣生長因子(IGF)-1R/AKT信號通路激活能夠促進人及多種生物體內一條高度保守的信號通路，研究表明在關節(jié)軟骨細胞IGF-1可明顯刺激軟骨細胞合成軟骨基質特異型蛋白〔1～3〕。本研究進一步探討RES促進細胞外基質表達的作用與該信號通路的關系。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 F12-DMEM培養(yǎng)基(Hyclone，USA)，Ⅱ型膠原酶(Sigma，USA)，胰蛋白酶(Hyclone，USA)，胎牛血清(Hyclone，USA)，COLA2α1 一抗、aggrecan一抗(Santa Cruz，USA);IGF-1R及 p IGF-1R一抗、AKT及 pAKT一抗(cell signaling，USA);HRP標記二抗(GenScript，USA);總RNA提取試劑盒、熒光定量 PCR試劑盒(閃晶公司，上海);IGF-1R拮抗劑AG1024(Santa Cruz，USA);AKT 拮抗劑 SH-5(Enzo，USA);PhosSTOP(Roche，USA)。JY300C 電游儀(北京君意)，UVP GDS8000凝膠成像系統(tǒng)(UVP，USA);FTC3000 real-time PCR儀(Funglyn Biotech，Canada)。

1.2 方法

1.2.1 人原代DEC的分離與培養(yǎng) 人椎間盤軟骨終板細胞獲取自腰椎間盤突出癥患者手術時刮除的軟骨終板，共23例，年齡61～75歲，平均年齡64.3歲，男17例，女6例;均經術前MRI及術后病理檢查診斷為為“椎間盤退變”。

手術時取得的軟骨終板標本，刀片刮除髓核及纖維環(huán)，剪碎至約1 mm3;PBS液沖洗2遍，離心(200 r/min，3 min)后加入約7～8倍體積的0.25%的胰蛋白酶液，37℃消化15 min，加入2～3 ml F12-DMEM培養(yǎng)基終止消化;離心(800 r/min，5 min)，棄上清液，PBS液沖洗2遍，加入含10%胎牛血清的0.2%Ⅱ型膠原酶，37℃下攪拌消化 4 h;200目細胞篩過濾，離心(800 r/min，5 min)，去除上清液，取細胞沉淀，加入含20%胎牛血清的F12-DMEM培養(yǎng)基，吹打細胞，鏡下計數，按2×104/ml密度種植于50 m l培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天換液1次，隔天用倒置顯微鏡觀察、拍照;細胞融合率90%左右時傳代，亦按2×104/ml密度接種。

1.2.2 研究設計及細胞處理 P2代細胞培養(yǎng)貼壁，融合度90%時，隨機分為5組，分別加入對應試劑:①DMSO溶劑對照組:用相當于Res溶劑劑量的DMSO作為對照;②空白對照組，只加入培養(yǎng)基，不加入其他試劑;③RES組:加入100μmol/L RES溶液(RES用DMSO溶解，DMSO濃度為0.1%);④RES+AG1024組:同時加入 100μmol/L RES溶液，20μmol/L AG1024(IGF-1R拮抗劑);⑤RES+SH-5組:同時加入100μmol/L的RES溶液，20μmol/L SH-5(AKT拮抗劑)。各組均在加入對應試劑后繼續(xù)培養(yǎng)12 h，培養(yǎng)終止后收集細胞，進行檢測。

1.2.3 細胞形態(tài)學觀察及免疫細胞化學染色鑒定 熒光倒置相差顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)并拍照。處理后的P2終板軟骨細胞行細胞爬片，以4%多聚甲醛固定20 min，3%過氧化氫室溫孵育10 min;蒸餾水沖洗，0.01 mol/L PBS浸洗5 min×3;5%的正常山羊血清(PBS稀釋)封閉15 min;傾去血清，滴加COLAⅡ和 aggrecan一抗(1∶100)，4℃過夜;PBS沖洗，5 min ×3;滴加適當比例稀釋的生物素標記二抗，37℃孵育20 min;PBS沖洗，5min×3;滴加適當比例稀釋的辣根過氧化酶標記鏈霉素，室溫孵育20 min;PBS沖洗，5 min×3;DAB自來水沖洗，37℃烘干，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。陰性對照試驗以抗體稀釋液代替一抗。

1.2.4 Western印跡檢測 棄去培養(yǎng)基，0.25%胰酶(不含EDTA)消化30 s～1 min，離心，棄培養(yǎng)基;數毫升冷PBS洗滌細胞，離心，重復兩次，收集細胞。加入0.5 ml冷RIPA裂解液，4℃下12 000 r/min離心10 min，收集上清液即為蛋白質粗提物。BCA法測定蛋白質濃度，取等量蛋白質樣品進行 SDSPAGE電泳，電轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，緩沖液沖洗3次，每次10 min;辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育 1 h，緩沖液洗滌3次，DAB顯色。ChemiDoc XRS曝光系統(tǒng)檢測蛋白條帶亮度，Quantity One分析蛋白條帶密度值和表達量。以GAPDH作內參。磷酸化蛋白檢測時裂解液中加入磷酸酶抑制劑PhosSTOP。

1.2.5 實時熒光定量PCR(Qrt PCR)檢測 按照試劑盒說明書的操作步驟進行總RNA提取及鑒定。配置PCR反應體系總體積301μl。3000實時熒光定量PCR儀上進行PCR反應并自動分析，以β-actin做內參。引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結果

2.1 細胞形態(tài)學觀察及免疫組化染色鑒定 原代培養(yǎng)時，細胞于3 d左右后開始逐漸貼壁，約7～9 d貼壁完全，細胞呈類圓形，輪廓清楚，細胞核呈圓形。10～12 d時細胞融合，連接成片，細胞融合率約80% ～90%時適宜傳代。傳代后，細胞于24 h后貼壁完全，于1 w左右細胞單層融合，系統(tǒng)逐漸變?yōu)殚L梭形。細胞傳至第2、3代時，細胞的形狀仍然保持為長梭形，至第4代時細胞已有部分呈現(xiàn)不規(guī)則多角形改變，呈鋪路石狀，胞體體積變小，生長變慢。COLAⅡ和aggrecan的免疫組織化學染色均可見陽性表達，胞漿呈棕黃色，而胞核未見染色，符合軟骨終板細胞的特點(見圖1)。

2.2 IGF-1R、AKT及其磷酸化水平的變化 采用Western印跡法檢測了各組細胞 IGF-1R、pIGF-1R、AKT、pAKT、COLAⅡ、aggrecan的蛋白表達水平(圖 2，表 2)。IGF-1Rβ亞基(Tyr1135/1136)位點的自身磷酸化是IGF-1R活化的關鍵磷酸化位點，AKT(Ser473)位點的磷酸化是代表Akt蛋白活化的關鍵磷酸化位點。五組細胞IGF-1R、AKT表達水平無顯著性差異(P＞0.05)，但是其對應的活性形式 pIGF-1R(Tyr1135/1136)、pAKT(Ser473)表達水平有顯著性差異(P＜0.05)。見表3。

表2 各組條帶灰度值比較(±s)

表2 各組條帶灰度值比較(±s)

與空白組比較:1)P＜0.05，與RES組比較:2)P＜0.05

1 419.14±61.45 DMSO組 287.67±12.59 42.34±5.202) 183.72±17.40 24.97±3.742) 635.05±39.842) 467.02±47.442) 1 396.4±88.93 RES組 294.712±19.57 124.44±15.671) 195.8±16.79 79.67±7.141) 1 138.70±81.471)1 068.48±61.781)1 481.7±88.65 RES+AG1024組 287.03±15.05 27.34±3.092) 182.74±13.46 7.74±1.452) 359.83±25.152) 286.93±19.312) 1 338.84±87.89 RES+SH-5組 274.29±18.80 106.33±8.941) 187.91±14.39 4.94±1.032) 304.29±21.922) 362.32±13.412)IGF-1R p IGF-1R AKT pAKT COLA aggrecan GAPDH空白組 311.87±26.70 54.42±7.052) 218.2±13.49 28.25±3.162) 2 717.27±31.922)568.04±39.792)組別1 329.4±81.02

表3 各組樣本實時熒光定量PCR的Ct值及2－△△Ct分析法結果

圖1 細胞形態(tài)學觀察及免疫組化染色鑒定

對pIGF-1R表達水平的差異進行組間比較。與空白對照p IGF-1R表達水平相比，RES組明顯升高(P＜0.05)，RES+AG1024組顯著降低(P＜0.05)，DMSO組及RES+SH-5組無顯著性差異(P＞0.05)。與RES組相比，RES+AG1024組顯著降低(P＜0.05)，RES+SH-5組無顯著性差異(P＞0.05)。

對pAKT表達水平的差異進行組間比較。與空白對照pAKT表達水平相比，RES組明顯升高(P＜0.05)，RES+AG1024組及RES+SH-5組均顯著降低(P＜0.05)，DMSO組無顯著性差異(P＞0.05)。與RES組相比，RES+AG1024組及 RES+SH-5組均顯著降低(P＜0.05)。

圖2 W estern印跡法檢測各組細胞IGF-1R、p IGF-1R、AKT、pAKT、COLAⅡ、aggrecan 蛋白的表達

上述結果表明，RES干預不能上調IGF-1R、AKT表達水平，在空白對照組pIGF-1R、pAKT也有較低水平的表達，提示在終板軟細胞中IGF-1R、AKT磷酸化是一個時刻在發(fā)生的生化反應。在加入RES干預后pIGF-1R、pAKT表達迅速上調，加入AG1024成功抑制了IGF-1R(Tyr1135/1136)位點磷酸化，加入SH-5成功抑制了Akt(Ser473)位點的磷酸化激活。

2.3 COLAⅡ、aggrecan表達水平的變化 5組細胞COLAⅡ及aggrecan表達水平有顯著性差異(P＜0.05)。組間比較表明，與空白對照組COLAⅡ及aggrecan表達水平相比，RES干預組明顯升高(P＜0.05)，DMSO組無顯著性差異，RES+AG1024組及RES+SH-5組稍有升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。與RES組比較，RES+AG1024組及RES+SH-5組表達水平顯著降低(P＜0.05)。上述結果表明，RES干預能夠顯著促進COLAⅡ及aggrecan合成，在加入AG1024和SH-5后，RES的該作用消失。見表2。2.4 COLAⅡ、aggrecan mRNA表達水平的變化 COLAⅡ、aggrecanmRNA表達水平采用2－ΔΔCT法進行分析，5組細胞之間表達水平有顯著性差異(P＜0.05)。組間比較表明，與空白對照組比較，DMSO組無顯著性差異(P＞0.05)，與空白對照組比較，DMSO組無顯著性差異，RES+AG1024組稍有升高，RES+SH-5組稍有降低，但差異無統(tǒng)計學顯著性(P＞0.05)。與RES組相比，RES+AG1024組及RES+SH-5組均顯著降低(P＜0.05)。RES干預能夠顯著上調COLAⅡ及aggrecan轉錄水平，在加入AG1024和SH-5后，RES的該作用消失。見表3。

3 討論

現(xiàn)已公認椎間盤退變是引起脊柱退行性疾病的主要原因，但引起椎間盤退變的確切機制目前尚不清楚。椎間盤是人體最大的缺氧組織，現(xiàn)有研究表明〔4，5〕，終板軟骨退變，彌散功能降低，椎間盤營養(yǎng)障礙及代謝產物排出障礙，加速并促進了椎間盤的退變。因此，終板軟骨細胞的退變在椎間盤退變的病理過程中發(fā)揮了至關重要的作用，預防并抑制終板軟骨的退變成為阻止椎間盤退變的潛在靶點。

終板軟骨的退變既包括軟骨細胞的凋亡，也包括細胞外基質成分下降，降解加速。軟骨細胞在未失去其表型的狀態(tài)下，主要分泌蛋白聚糖和Ⅱ型膠原，是關節(jié)軟骨的重要組成成分，對維持關節(jié)軟骨的生理功能具有重要作用。實驗證實〔6〕，退變腰椎軟骨終板細胞合成COLAⅡ能力下降。因此，COLAⅡ及aggrecan的代謝改變和信息調控是研究軟骨基質代謝障礙的關鍵靶點。

既往研究表明〔1～3〕，IGF-1可明顯地促進多種來源的關節(jié)軟骨細胞分裂增殖，軟骨基質特異性成分Ⅱ型膠原和蛋白多糖的合成，增強成骨細胞的堿性磷酸酯酶的活性。

AG1024是IGF-1R的特異性抑制劑，能夠競爭受體胞漿區(qū)ATP結合位點，抑制 IGF-1R的自身磷酸化，從而抑制 IGF-1R的活化，降低細胞內 p IGF-1R 水平〔7，8〕。

本研究表明RES促進退變椎間盤終板軟骨細胞合成細胞外基質的作用與上調IGF-1R磷酸化水平，激活IGF-1R信號轉導通路有關。

AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可被多種生長因子激活，如胰島素樣生長因子〔9，10〕、神經生長因子〔11〕、血小板源性生長因子〔12〕。AKT 是 IGF-1R 信號通路的下游分子〔10，13〕，IGF-1R激活后活化PI3K，產生第二信使PIP3，PIP3與PDK1結合從而激活PDK1，活化的PDK1使得AKT中(Ser 473)位點磷酸化，使得AKT激活成為pAKT〔14〕。pAKT通過磷酸化作用激活或抑制一系列下游靶蛋白，如 Bad、Caspase9、NF-κB、GSK-3、FKHR、p21Cip1和p27 Kip1等，進而調節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡以及遷移等。SH-5是磷脂酰肌醇類似物，作用于與AKT的PH域，阻礙AKT向細胞膜的遷移和活化〔15，16〕，是 AKT的特異性抑制劑。

本研究結果顯示，RES刺激不能促進AKT蛋白表達，但是能夠促進AKT的磷酸化，提高pIGF-1R含量，從而激活下游通路信號分子，上調COLAⅡ、aggrecan基因轉錄水平;加入SH-5抑制了AKT的活化后，pAKT水平下降，RES促進細胞外基質合成的作用消失，表明RES促進退變椎間盤終板軟骨細胞合成細胞外基質的作用與上調AKT磷酸化水平，激活AKT信號轉導通路有關。

1 Starkman BG，Cravero JD，Delcarlo M，et al.IGF-I stimulation of proteoglycan synthesis by chondrocytes requires activation of the PI 3-kinase pathway but not ERK MAPK〔J〕.Biochem J，2005;389(Pt3):723-9.

2 Zhang M，Zhou Q，Liang QQ，et al.IGF-1 regulation of typeⅡ collagen and MMP-13 expression in ratendplate chondrocytes via distinct signaling pathways〔J〕.Osteoarthritis Cartilage，2009;17(1):100-6.

3 Veilleux N，Spector M.Effects of FGF-2 and IGF-1 on adult canine articular chondrocytes in typeⅡcollagen-glycosaminoglycan scaffolds in vitro〔J〕.Osteoarthritis Cartilage，2005;13(4):278-86.

4 Peng BGHS，ShiQ，etal.The relationship between cartilage endplate calcification and disc degeneration:an experimental study〔J〕.Chin Med J，2001;3:308-12.

5 Gruber HE，Gordon B，Williams C，et al.Vertebral endplate and disc changes in the aging sand rat lumbar spine:cross-sectional analyses of a largemale and female population〔J〕.Spine，2007;2(3):2529-36.

6 王 飛，江建明，王鳳龍，等.退變腰椎軟骨終板細胞生物學特征實驗研究〔J〕.南方醫(yī)科大學學報，2010;30(4):871-4.

7 Chu CH，Huang CY，Lu MC，et al.Enhancement of AG1024-induced H9c2 cardiomyoblast cell apoptosis via the interaction of IGF2R with Galpha proteinsand its downstream PKA and PLC-betamodulatorsby IGF-II〔J〕.Chin JPhysiol，2009;52(1):31-7.

8 Kisielewska J，Ligeza J，Klein A.The effect of tyrosine kinase inhibitors，tyrphostins:AG1024 and SU1498，on autocrine growth of prostate cancer cells(DU145)〔J〕.Folia Histochem Cytobiol，2008;46(2):185-91.

9 Fuentes EN，Bjornsson BT，Valdes JA，etal.IGF-I/PI3K/Akt and IGF-I/MAPK/ERK pathways in vivo in skeletalmuscle are regulated by nutrition and contribute to somatic growth in the fine flounder〔J〕.Am JPhysiol Regul Integr Comp Physiol，2011;300(6):R1532-42.

10 Chapuis N，Tamburini J，Cornillet-Lefebvre P，et al.Autocrine IGF-1/IGF-1R signaling is responsible for constitutive PI3K/Akt activation in acutemyeloid leukemia:therapeutic value of neutralizing anti-IGF-1R antibody〔J〕.Haematologica，2010;95(3):415-23.

11 Jeon S，Park JK，Bae CD，et al.NGF-induced moesin phosphorylation is mediated by the PI3K，Rac1 and Akt and required for neurite formation in PC12 cells〔J〕.Neurochem Int，2010;56(6-7):810-8.

12 Vantler M，Huntgeburth M，Caglayan E，etal.PI3-kinase/Akt-dependent antiapoptotic signaling by the PDGF alpha receptor is negatively regulated by Src family kinases〔J〕.FEBS Lett，2006;580(30):6769-76.

13 Leclerc GM，Leclerc GJ，F(xiàn)u G，etal.AMPK-induced activation of Aktby AICAR ismediated by IGF-1R dependent and independentmechanisms in acute lymphoblastic leukemia〔J〕.JMol Signal，2010;5:15.

14 Hirsch E，Costa C，Ciraolo E.Phosphoinositide 3-kinases as a common platform formulti-hormone signaling〔J〕.J Endocrinol，2007;194(2):243-56.

15 Krech T，Thiede M，Hilgenberg E，et al.Characterization of AKT independent effects of the synthetic AKT inhibitors SH-5 and SH-6 using an integrated approach combining transcriptomic profiling and signaling pathway perturbations〔J〕.BMC Cancer，2010;10:287.

16 Sethi G，Ahn KS，Sung B，et al.SH-5，an AKT inhibitor potentiates apoptosis and inhibits invasion through the suppression of anti-apoptotic，proliferative and metastatic gene products regulated by IkappaBalpha kinase activation〔J〕.Biochem Pharmacol，2008;76(11):1404-16.

Resveratrol stimulate the extracellular matrix synthesis of endplate chondrocytes via activating IGF-1R/AKT pathway

ZHONG Xiao-M ing，HU Zhen-M ing，SHEN Jie-Liang，et al.
Department of Orthopaedics，the First Affiliated Hospital，Chongqing M edical University，Chongqing 400016，China

ObjectiveTo explore the effect of IGF-1R/AKT pathway on extracellularmatrix synthesis of disc endplate chondrocytes stimulated by resveratrol.MethodsP2 generation of endplate chondrocyteswere random ly divided into 5 groups and stimulated with corresponding reagent for 12 hours.Expression levels of IGF-1R，p IGF-1R，AKT，pAKT，COLAⅡ and aggrecan were detected by Western blotting technique.ResultsResveratrol intervention could significantly increase the phosphorylation levels of both IGFR and AKT，and stimulate the synthesis of COLAⅡ and aggrecan.AG1024 and SH-5 significantly inhibited the phosphorylation ofboth IGFR and AKT，and inhibit the synthesis of COLAⅡand aggrecan.ConclusionsResveratrol could stimulate the extracellularmatrix synthesis of disc endplate chondrocytes via IGF-1R/AKT regulatory pathway.

Resveratrol;IGF-1R;AKT;Phosphorylation;Endplate chondrocytes;Extracellularmatrix

R602

A

1005-9202(2012)12-2533-05;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.12.042

國家自然科學基金(No.81171751)

胡偵明(1962-)，男，教授，博士生導師，主要從事脊柱外科臨床與基礎研究。

鐘小明(1981-)，男，博士，主治醫(yī)師，主要從事脊柱退行性疾病的發(fā)病機制及治療研究。

〔2012-02-10收稿 2012-03-15修回〕

(編輯 曹夢園)