鐘小明 胡偵明 沈皆亮 甘 強 郝 杰 (重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院骨科，重慶 400016)

白藜蘆醇激活I(lǐng)GF-1R/AKT通路對退變椎間盤終板軟骨細胞合成細胞外基質(zhì)的影響及其機制

鐘小明 胡偵明 沈皆亮 甘 強 郝 杰 (重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院骨科，重慶 400016)

目的探討白藜蘆醇對椎間盤軟骨終板細胞合成細胞外基質(zhì)的影響及其機制。方法椎間盤軟骨終板細胞培養(yǎng)，傳代，P2代細胞培養(yǎng)48 h后，隨機分為5組，各組加入對應(yīng)試劑培養(yǎng)12 h后終止培養(yǎng)，檢測胰島素樣生長因子(IGF)-1R、p IGF-1R、蛋白激酶B(AKT)、pAKT、Ⅱ型膠原(COLAⅡ)、aggrecan的表達變化。結(jié)果白藜蘆醇干預(yù)后IGF-1R及AKT磷酸化水平顯著增加，COLAⅡ、aggrecan基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，COLAⅡ、aggrecan合成增加;加入AG1024及SH-5抑制了IGF-1R及AKT磷酸化激活，COLAⅡ、aggrecan基因轉(zhuǎn)錄水平下降，COLAⅡ、aggrecan合成減少。結(jié)論

白藜蘆醇可促進退變椎間盤軟骨終板細胞合成細胞外基質(zhì)COLAⅡ、aggrecan，抑制軟骨終板退變，其機制與激活I(lǐng)GF-1R/AKT信號通路有關(guān)。

白藜蘆醇;胰島素樣生長因子1受體;IGF-1R;蛋白激酶B;磷酸化;軟骨終板細胞;細胞外基質(zhì)

白藜蘆醇(RES)是廣泛存在于葡萄酒、水果、中藥中的一種植物抗毒素和抗氧化劑，能夠發(fā)揮保護機體、抵抗各種應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的作用。目前，尚缺乏RES對椎間盤細胞抑制退變方面的研究。我們的前期研究表明RES能夠通過促進椎間盤終板軟骨細胞特異性細胞外基質(zhì)成分(2型膠原和aggrecan)的表達，但關(guān)于其機制目前并無相關(guān)報道。胰島素樣生長因子(IGF)-1R/AKT信號通路激活能夠促進人及多種生物體內(nèi)一條高度保守的信號通路，研究表明在關(guān)節(jié)軟骨細胞IGF-1可明顯刺激軟骨細胞合成軟骨基質(zhì)特異型蛋白〔1～3〕。本研究進一步探討RES促進細胞外基質(zhì)表達的作用與該信號通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 F12-DMEM培養(yǎng)基(Hyclone，USA)，Ⅱ型膠原酶(Sigma，USA)，胰蛋白酶(Hyclone，USA)，胎牛血清(Hyclone，USA)，COLA2α1 一抗、aggrecan一抗(Santa Cruz，USA);IGF-1R及 p IGF-1R一抗、AKT及 pAKT一抗(cell signaling，USA);HRP標記二抗(GenScript，USA);總RNA提取試劑盒、熒光定量 PCR試劑盒(閃晶公司，上海);IGF-1R拮抗劑AG1024(Santa Cruz，USA);AKT 拮抗劑 SH-5(Enzo，USA);PhosSTOP(Roche，USA)。JY300C 電游儀(北京君意)，UVP GDS8000凝膠成像系統(tǒng)(UVP，USA);FTC3000 real-time PCR儀(Funglyn Biotech，Canada)。

1.2 方法

1.2.1 人原代DEC的分離與培養(yǎng) 人椎間盤軟骨終板細胞獲取自腰椎間盤突出癥患者手術(shù)時刮除的軟骨終板，共23例，年齡61～75歲，平均年齡64.3歲，男17例，女6例;均經(jīng)術(shù)前MRI及術(shù)后病理檢查診斷為為“椎間盤退變”。

手術(shù)時取得的軟骨終板標本，刀片刮除髓核及纖維環(huán)，剪碎至約1 mm3;PBS液沖洗2遍，離心(200 r/min，3 min)后加入約7～8倍體積的0.25%的胰蛋白酶液，37℃消化15 min，加入2～3 ml F12-DMEM培養(yǎng)基終止消化;離心(800 r/min，5 min)，棄上清液，PBS液沖洗2遍，加入含10%胎牛血清的0.2%Ⅱ型膠原酶，37℃下攪拌消化 4 h;200目細胞篩過濾，離心(800 r/min，5 min)，去除上清液，取細胞沉淀，加入含20%胎牛血清的F12-DMEM培養(yǎng)基，吹打細胞，鏡下計數(shù)，按2×104/ml密度種植于50 m l培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天換液1次，隔天用倒置顯微鏡觀察、拍照;細胞融合率90%左右時傳代，亦按2×104/ml密度接種。

1.2.2 研究設(shè)計及細胞處理 P2代細胞培養(yǎng)貼壁，融合度90%時，隨機分為5組，分別加入對應(yīng)試劑:①DMSO溶劑對照組:用相當于Res溶劑劑量的DMSO作為對照;②空白對照組，只加入培養(yǎng)基，不加入其他試劑;③RES組:加入100μmol/L RES溶液(RES用DMSO溶解，DMSO濃度為0.1%);④RES+AG1024組:同時加入 100μmol/L RES溶液，20μmol/L AG1024(IGF-1R拮抗劑);⑤RES+SH-5組:同時加入100μmol/L的RES溶液，20μmol/L SH-5(AKT拮抗劑)。各組均在加入對應(yīng)試劑后繼續(xù)培養(yǎng)12 h，培養(yǎng)終止后收集細胞，進行檢測。

1.2.3 細胞形態(tài)學觀察及免疫細胞化學染色鑒定 熒光倒置相差顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)并拍照。處理后的P2終板軟骨細胞行細胞爬片，以4%多聚甲醛固定20 min，3%過氧化氫室溫孵育10 min;蒸餾水沖洗，0.01 mol/L PBS浸洗5 min×3;5%的正常山羊血清(PBS稀釋)封閉15 min;傾去血清，滴加COLAⅡ和 aggrecan一抗(1∶100)，4℃過夜;PBS沖洗，5 min ×3;滴加適當比例稀釋的生物素標記二抗，37℃孵育20 min;PBS沖洗，5min×3;滴加適當比例稀釋的辣根過氧化酶標記鏈霉素，室溫孵育20 min;PBS沖洗，5 min×3;DAB自來水沖洗，37℃烘干，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。陰性對照試驗以抗體稀釋液代替一抗。

1.2.4 Western印跡檢測 棄去培養(yǎng)基，0.25%胰酶(不含EDTA)消化30 s～1 min，離心，棄培養(yǎng)基;數(shù)毫升冷PBS洗滌細胞，離心，重復(fù)兩次，收集細胞。加入0.5 ml冷RIPA裂解液，4℃下12 000 r/min離心10 min，收集上清液即為蛋白質(zhì)粗提物。BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，取等量蛋白質(zhì)樣品進行 SDSPAGE電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，緩沖液沖洗3次，每次10 min;辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育 1 h，緩沖液洗滌3次，DAB顯色。ChemiDoc XRS曝光系統(tǒng)檢測蛋白條帶亮度，Quantity One分析蛋白條帶密度值和表達量。以GAPDH作內(nèi)參。磷酸化蛋白檢測時裂解液中加入磷酸酶抑制劑PhosSTOP。

1.2.5 實時熒光定量PCR(Qrt PCR)檢測 按照試劑盒說明書的操作步驟進行總RNA提取及鑒定。配置PCR反應(yīng)體系總體積301μl。3000實時熒光定量PCR儀上進行PCR反應(yīng)并自動分析，以β-actin做內(nèi)參。引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)學觀察及免疫組化染色鑒定 原代培養(yǎng)時，細胞于3 d左右后開始逐漸貼壁，約7～9 d貼壁完全，細胞呈類圓形，輪廓清楚，細胞核呈圓形。10～12 d時細胞融合，連接成片，細胞融合率約80% ～90%時適宜傳代。傳代后，細胞于24 h后貼壁完全，于1 w左右細胞單層融合，系統(tǒng)逐漸變?yōu)殚L梭形。細胞傳至第2、3代時，細胞的形狀仍然保持為長梭形，至第4代時細胞已有部分呈現(xiàn)不規(guī)則多角形改變，呈鋪路石狀，胞體體積變小，生長變慢。COLAⅡ和aggrecan的免疫組織化學染色均可見陽性表達，胞漿呈棕黃色，而胞核未見染色，符合軟骨終板細胞的特點(見圖1)。

2.2 IGF-1R、AKT及其磷酸化水平的變化 采用Western印跡法檢測了各組細胞 IGF-1R、pIGF-1R、AKT、pAKT、COLAⅡ、aggrecan的蛋白表達水平(圖 2，表 2)。IGF-1Rβ亞基(Tyr1135/1136)位點的自身磷酸化是IGF-1R活化的關(guān)鍵磷酸化位點，AKT(Ser473)位點的磷酸化是代表Akt蛋白活化的關(guān)鍵磷酸化位點。五組細胞IGF-1R、AKT表達水平無顯著性差異(P＞0.05)，但是其對應(yīng)的活性形式 pIGF-1R(Tyr1135/1136)、pAKT(Ser473)表達水平有顯著性差異(P＜0.05)。見表3。

表2 各組條帶灰度值比較(±s)

表2 各組條帶灰度值比較(±s)

與空白組比較:1)P＜0.05，與RES組比較:2)P＜0.05

1 419.14±61.45 DMSO組 287.67±12.59 42.34±5.202) 183.72±17.40 24.97±3.742) 635.05±39.842) 467.02±47.442) 1 396.4±88.93 RES組 294.712±19.57 124.44±15.671) 195.8±16.79 79.67±7.141) 1 138.70±81.471)1 068.48±61.781)1 481.7±88.65 RES+AG1024組 287.03±15.05 27.34±3.092) 182.74±13.46 7.74±1.452) 359.83±25.152) 286.93±19.312) 1 338.84±87.89 RES+SH-5組 274.29±18.80 106.33±8.941) 187.91±14.39 4.94±1.032) 304.29±21.922) 362.32±13.412)IGF-1R p IGF-1R AKT pAKT COLA aggrecan GAPDH空白組 311.87±26.70 54.42±7.052) 218.2±13.49 28.25±3.162) 2 717.27±31.922)568.04±39.792)組別1 329.4±81.02

表3 各組樣本實時熒光定量PCR的Ct值及2－△△Ct分析法結(jié)果

圖1 細胞形態(tài)學觀察及免疫組化染色鑒定

對pIGF-1R表達水平的差異進行組間比較。與空白對照p IGF-1R表達水平相比，RES組明顯升高(P＜0.05)，RES+AG1024組顯著降低(P＜0.05)，DMSO組及RES+SH-5組無顯著性差異(P＞0.05)。與RES組相比，RES+AG1024組顯著降低(P＜0.05)，RES+SH-5組無顯著性差異(P＞0.05)。

對pAKT表達水平的差異進行組間比較。與空白對照pAKT表達水平相比，RES組明顯升高(P＜0.05)，RES+AG1024組及RES+SH-5組均顯著降低(P＜0.05)，DMSO組無顯著性差異(P＞0.05)。與RES組相比，RES+AG1024組及 RES+SH-5組均顯著降低(P＜0.05)。

圖2 W estern印跡法檢測各組細胞IGF-1R、p IGF-1R、AKT、pAKT、COLAⅡ、aggrecan 蛋白的表達

上述結(jié)果表明，RES干預(yù)不能上調(diào)IGF-1R、AKT表達水平，在空白對照組pIGF-1R、pAKT也有較低水平的表達，提示在終板軟細胞中IGF-1R、AKT磷酸化是一個時刻在發(fā)生的生化反應(yīng)。在加入RES干預(yù)后pIGF-1R、pAKT表達迅速上調(diào)，加入AG1024成功抑制了IGF-1R(Tyr1135/1136)位點磷酸化，加入SH-5成功抑制了Akt(Ser473)位點的磷酸化激活。

2.3 COLAⅡ、aggrecan表達水平的變化 5組細胞COLAⅡ及aggrecan表達水平有顯著性差異(P＜0.05)。組間比較表明，與空白對照組COLAⅡ及aggrecan表達水平相比，RES干預(yù)組明顯升高(P＜0.05)，DMSO組無顯著性差異，RES+AG1024組及RES+SH-5組稍有升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。與RES組比較，RES+AG1024組及RES+SH-5組表達水平顯著降低(P＜0.05)。上述結(jié)果表明，RES干預(yù)能夠顯著促進COLAⅡ及aggrecan合成，在加入AG1024和SH-5后，RES的該作用消失。見表2。2.4 COLAⅡ、aggrecan mRNA表達水平的變化 COLAⅡ、aggrecanmRNA表達水平采用2－ΔΔCT法進行分析，5組細胞之間表達水平有顯著性差異(P＜0.05)。組間比較表明，與空白對照組比較，DMSO組無顯著性差異(P＞0.05)，與空白對照組比較，DMSO組無顯著性差異，RES+AG1024組稍有升高，RES+SH-5組稍有降低，但差異無統(tǒng)計學顯著性(P＞0.05)。與RES組相比，RES+AG1024組及RES+SH-5組均顯著降低(P＜0.05)。RES干預(yù)能夠顯著上調(diào)COLAⅡ及aggrecan轉(zhuǎn)錄水平，在加入AG1024和SH-5后，RES的該作用消失。見表3。

3 討論

現(xiàn)已公認椎間盤退變是引起脊柱退行性疾病的主要原因，但引起椎間盤退變的確切機制目前尚不清楚。椎間盤是人體最大的缺氧組織，現(xiàn)有研究表明〔4，5〕，終板軟骨退變，彌散功能降低，椎間盤營養(yǎng)障礙及代謝產(chǎn)物排出障礙，加速并促進了椎間盤的退變。因此，終板軟骨細胞的退變在椎間盤退變的病理過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，預(yù)防并抑制終板軟骨的退變成為阻止椎間盤退變的潛在靶點。

終板軟骨的退變既包括軟骨細胞的凋亡，也包括細胞外基質(zhì)成分下降，降解加速。軟骨細胞在未失去其表型的狀態(tài)下，主要分泌蛋白聚糖和Ⅱ型膠原，是關(guān)節(jié)軟骨的重要組成成分，對維持關(guān)節(jié)軟骨的生理功能具有重要作用。實驗證實〔6〕，退變腰椎軟骨終板細胞合成COLAⅡ能力下降。因此，COLAⅡ及aggrecan的代謝改變和信息調(diào)控是研究軟骨基質(zhì)代謝障礙的關(guān)鍵靶點。

既往研究表明〔1～3〕，IGF-1可明顯地促進多種來源的關(guān)節(jié)軟骨細胞分裂增殖，軟骨基質(zhì)特異性成分Ⅱ型膠原和蛋白多糖的合成，增強成骨細胞的堿性磷酸酯酶的活性。

AG1024是IGF-1R的特異性抑制劑，能夠競爭受體胞漿區(qū)ATP結(jié)合位點，抑制 IGF-1R的自身磷酸化，從而抑制 IGF-1R的活化，降低細胞內(nèi) p IGF-1R 水平〔7，8〕。

本研究表明RES促進退變椎間盤終板軟骨細胞合成細胞外基質(zhì)的作用與上調(diào)IGF-1R磷酸化水平，激活I(lǐng)GF-1R信號轉(zhuǎn)導通路有關(guān)。

AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可被多種生長因子激活，如胰島素樣生長因子〔9，10〕、神經(jīng)生長因子〔11〕、血小板源性生長因子〔12〕。AKT 是 IGF-1R 信號通路的下游分子〔10，13〕，IGF-1R激活后活化PI3K，產(chǎn)生第二信使PIP3，PIP3與PDK1結(jié)合從而激活PDK1，活化的PDK1使得AKT中(Ser 473)位點磷酸化，使得AKT激活成為pAKT〔14〕。pAKT通過磷酸化作用激活或抑制一系列下游靶蛋白，如 Bad、Caspase9、NF-κB、GSK-3、FKHR、p21Cip1和p27 Kip1等，進而調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡以及遷移等。SH-5是磷脂酰肌醇類似物，作用于與AKT的PH域，阻礙AKT向細胞膜的遷移和活化〔15，16〕，是 AKT的特異性抑制劑。

本研究結(jié)果顯示，RES刺激不能促進AKT蛋白表達，但是能夠促進AKT的磷酸化，提高pIGF-1R含量，從而激活下游通路信號分子，上調(diào)COLAⅡ、aggrecan基因轉(zhuǎn)錄水平;加入SH-5抑制了AKT的活化后，pAKT水平下降，RES促進細胞外基質(zhì)合成的作用消失，表明RES促進退變椎間盤終板軟骨細胞合成細胞外基質(zhì)的作用與上調(diào)AKT磷酸化水平，激活A(yù)KT信號轉(zhuǎn)導通路有關(guān)。

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Resveratrol stimulate the extracellular matrix synthesis of endplate chondrocytes via activating IGF-1R/AKT pathway

ZHONG Xiao-M ing，HU Zhen-M ing，SHEN Jie-Liang，et al.
Department of Orthopaedics，the First Affiliated Hospital，Chongqing M edical University，Chongqing 400016，China

ObjectiveTo explore the effect of IGF-1R/AKT pathway on extracellularmatrix synthesis of disc endplate chondrocytes stimulated by resveratrol.MethodsP2 generation of endplate chondrocyteswere random ly divided into 5 groups and stimulated with corresponding reagent for 12 hours.Expression levels of IGF-1R，p IGF-1R，AKT，pAKT，COLAⅡ and aggrecan were detected by Western blotting technique.ResultsResveratrol intervention could significantly increase the phosphorylation levels of both IGFR and AKT，and stimulate the synthesis of COLAⅡ and aggrecan.AG1024 and SH-5 significantly inhibited the phosphorylation ofboth IGFR and AKT，and inhibit the synthesis of COLAⅡand aggrecan.ConclusionsResveratrol could stimulate the extracellularmatrix synthesis of disc endplate chondrocytes via IGF-1R/AKT regulatory pathway.

Resveratrol;IGF-1R;AKT;Phosphorylation;Endplate chondrocytes;Extracellularmatrix

R602

A

1005-9202(2012)12-2533-05;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.12.042

國家自然科學基金(No.81171751)

胡偵明(1962-)，男，教授，博士生導師，主要從事脊柱外科臨床與基礎(chǔ)研究。

鐘小明(1981-)，男，博士，主治醫(yī)師，主要從事脊柱退行性疾病的發(fā)病機制及治療研究。

〔2012-02-10收稿 2012-03-15修回〕

(編輯 曹夢園)