李 楠 何志義 (錦州市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 錦州 200)

PDE4D基因多態(tài)性與遼寧省漢族人群缺血性腦卒中的相關(guān)性

李 楠 何志義1(錦州市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 錦州 121001)

目的探討磷酸二酯酶(PDE)4D基因多態(tài)性與遼寧省漢族人群缺血性腦卒中(IS)潛在的遺傳發(fā)病機(jī)制分子流行病學(xué)依據(jù)。方法 采用病例對(duì)照的研究方法，檢測(cè)PDE4D基因多態(tài)性位點(diǎn)SNP83、SNP 87、SNP219和SNP220在病例組、對(duì)照組中的頻率分布。結(jié)果病例組SNP83位點(diǎn)CC基因型和C等位基因型頻率分布均高于對(duì)照組(CC:P=0.001;OR=1.788;95%CI:1.280～2.497;C:P=0.003;OR=1.368;95%CI:1.115～1.678)。SNP219位點(diǎn)AA基因型和A等位基因型頻率高于對(duì)照組(AA:P=0.029;OR=1.444;95%CI:1.037～2.010;A:P=0.048;OR=1.228;95%CI:1.001～1.505)。經(jīng)條件Logistic回歸校正后，SNP83CC基因型分布頻率仍然高于對(duì)照組(P=0.036;OR=1.603;95%CI:1.032～2.489)，SNP219AA基因型分布頻率也仍然高于對(duì)照組(P=0.046;OR=1.567;95%CI:1.008～2.436)。由SNP219、SNP220位點(diǎn)構(gòu)建的單體型中，AA單體型頻率病例組高于對(duì)照組(P=0.013;OR=1.296;95%CI:1.056～1.591)。GA單體型頻率病例組低于對(duì)照組(P=0.005;OR=0.650;95%CI:0.482～0.878)。結(jié)論P(yáng)DE4D基因SNP83、SNP219位點(diǎn)可能與遼寧省漢族人群大血管性IS具有相關(guān)性，而在由SNP219、SNP220位點(diǎn)構(gòu)建的單體型中，AA可能是危險(xiǎn)性單體型，GA可能是保護(hù)性單體型。

缺血性卒中;磷酸二酯酶4D;基因型;單體型

缺血性腦卒中(IS)目前被認(rèn)為是由遺傳因素與環(huán)境因素相互作用所致的復(fù)雜性疾病，而遺傳因素在其發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用。磷酸二酯酶(PDE)4D基因于2003年被冰島的deCODE遺傳學(xué)研究組發(fā)現(xiàn)與IS具有密切相關(guān)性〔1，2〕。該基因定位于人類常染色體5q12，編碼產(chǎn)物為環(huán)核苷PDE，主要存在于各種炎性細(xì)胞內(nèi)，能夠選擇性降解第二信使環(huán)磷酸腺苷(cAMP)。cAMP在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和諸多生理學(xué)反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其水平的降低可以導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，這是動(dòng)脈粥樣硬化的主要過程之一，而腦動(dòng)脈粥樣硬化目前被公認(rèn)為是IS的發(fā)病基礎(chǔ)。由此可以推測(cè)該基因可能與腦卒中的病理生理機(jī)制相關(guān)。在deCODE研究組發(fā)現(xiàn)PDE4D基因后，其他一些針對(duì)不同的人群進(jìn)行的一系列相關(guān)研究，驗(yàn)證該基因與IS之間是否具有確切的相關(guān)性，目前國(guó)內(nèi)外的研究結(jié)果大相徑庭〔3～12〕。目前國(guó)內(nèi)該方面的資料尚不完善。因此，本課題立足于遼寧省漢族人群，探討PDE4D基因多態(tài)性與IS之間的關(guān)系，以期為探尋該病的易患基因提供一定的分子遺傳學(xué)方面的證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 受試對(duì)象 病例組所有IS病人選自2009年12月至2011年1月于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、盛京醫(yī)院、遼寧省人民醫(yī)院、錦州市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的患者，共計(jì)371例，年齡41～74〔平均(63.88±7.36)〕歲，均屬遼寧漢族人群，男230例，女141例，彼此無親緣關(guān)系。全部病例經(jīng)詳細(xì)詢問病史、體格檢查以及參照頭部CT或MRI檢查結(jié)果，均符合國(guó)際疾病分類第 9版(ICD9)的 IS診斷標(biāo)準(zhǔn)，均屬于 IS分型(TOAST)中的大血管性IS。排除標(biāo)準(zhǔn)包括:腦出血、腦栓塞、蛛網(wǎng)膜下腔出血、膠原病、血管炎性疾病所致腦梗死、腦淀粉樣血管病、動(dòng)靜脈畸形。對(duì)照組371例，選自上述醫(yī)院體檢中心的健康體檢者或其他臨床科室無遺傳性疾病、無神經(jīng)系統(tǒng)疾病及無急慢性炎癥的住院病人，男247例，女124例，年齡42～72〔平均(62.87±7.57)〕歲，彼此之間無血緣關(guān)系。兩組在年齡、性別構(gòu)成及罹患高膽固醇血癥的數(shù)量方面無顯著差異(P＞0.05)，病例組患高血壓、糖尿病及吸煙者的數(shù)量與對(duì)照組相比顯著增高(P＜0.05)。見表1。在課題開始前，所有受試者均簽署知情同意書，并報(bào)請(qǐng)各醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 DNA的制備 以Promega公司基因組DNA提取試劑盒提取所有受試者的基因組DNA，檢測(cè)其純度和濃度后，置于－20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的選擇 選取deCODE研究組在冰島人群中證實(shí)與IS相關(guān)的PDE4D基因多態(tài)性位點(diǎn)SNP83、SNP 87、SNP219 和 SNP220 展開研究。

1.2.3 SNP83和SNP87位點(diǎn)的檢測(cè) 利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)對(duì)這兩個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，應(yīng)用Primer5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，具體引物序列、限制性核酸內(nèi)切酶的種類以及反應(yīng)條件見表2。

酶切結(jié)果的判定:經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶Tail消化后，含有C等位基因型的SNP83位點(diǎn)可以被Tail酶切為264、95 bp兩條電泳條帶，如果酶切結(jié)果含有264、95 bp兩條電泳條帶，則可以判定為C/C型純合子，如果酶切結(jié)果只有359 bp一條電泳條帶則可以判定為T/T型純合子，如果酶切結(jié)果為264、95、359 bp三條電泳條帶則判定為C/T型雜合子。見圖1。

經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶SSPⅠ消化后，SNP87位點(diǎn)含有T/T等位基因型的純合子可以被限制性核酸內(nèi)切酶SSPⅠ切為264、222 bp兩條電泳條帶，T/C型雜合子為486、264和222 bp三條電泳條帶，C/C型純合子為486 bp一條電泳條帶。見圖2。

表1 病例組和對(duì)照組受試者的基本資料〔n(%)〕

表2 引物序列、限制性核酸內(nèi)切酶的種類以及反應(yīng)條件

1.2.4 基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜引物延伸(MALDI-TOF-PEX)技術(shù)檢測(cè) PDE4D基因 SNP219、SNP220位點(diǎn)多態(tài)性 PCR引物和單堿基延伸引物均采用Assay Designer(Sequenom)軟件包設(shè)計(jì)。

SNP219引物:前向:5'-ACGTTGGATGGCACTCAGGTTAAATCTACCA-3';反 向:5'-ACGTTGGATGCTAATGACTTTTGTTCAACTG-3';延伸引物為:5'-TGTTCAACTGTATCACTCT-3'。

SNP220引物:前向:5'-ACGTTGGATGTGGTGAGCACAATCCTTGAG-3';反向:5'-ACGTTGGATGTTCCCTTGGGTGGAAAACT C-3';延伸引物為:5'-CTCCTCTCTCTGTTCCT-3'。MALDI-TOFPEX技術(shù)鑒定多態(tài)性位點(diǎn)基因型步驟如下:第一步為PCR擴(kuò)增反應(yīng);第二步應(yīng)用堿性磷酸酶將PCR擴(kuò)增后，剩余的dNTP消化掉;第三步為單堿基引物延伸反應(yīng);最后進(jìn)行質(zhì)譜儀點(diǎn)樣分析。最終結(jié)果由MassARRAY RT軟件系統(tǒng)(版本號(hào)3.0.0.4)實(shí)時(shí)讀取，并由MassARRAY Typer軟件系統(tǒng)(版本號(hào)3.4)完成基因分型分析。

結(jié)果判定:當(dāng)SNP219位點(diǎn)等位基因?yàn)锳時(shí)，特異性引物延伸一個(gè)dA堿基，等位基因?yàn)镚時(shí)，特異性引物延伸一個(gè)dG堿基，因此如果待測(cè)樣本為AA型純合子，引物延伸可見到一個(gè)A信號(hào)峰;如果為AG型雜合子，可見到一個(gè)A信號(hào)峰和一個(gè)G信號(hào)峰;如果為GG型純合子，可見到一個(gè)G信號(hào)峰。同理，當(dāng)SNP220位點(diǎn)等位基因?yàn)锳時(shí)，特異性引物延伸一個(gè)dA堿基，等位基因?yàn)镃時(shí)，特異性引物延伸一個(gè)dC堿基，因此如果待測(cè)樣本為AA型純合子，引物延伸可見到一個(gè)A信號(hào)峰;如果為AC型雜合子，可見到一個(gè)A信號(hào)峰和一個(gè)C信號(hào)峰;如果為CC型純合子，可見到一個(gè)G信號(hào)峰。見圖3。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS11.0軟件分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，多因素分析采用Logistic回歸。

圖1 SNP83位點(diǎn)經(jīng)Tail酶切后電泳圖

圖2 SNP87位點(diǎn)經(jīng)SSPⅠ酶切后電泳圖

圖3 1例樣本經(jīng)MALDI-TOF-PEX技術(shù)檢測(cè)后的峰圖

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) 病例組和對(duì)照組的SNPs位點(diǎn)基因型頻率分布沒有偏離Hardy-Weinberg平衡。所以，本研究選擇的研究人群基因頻率能夠代表群體的基因分布。

2.2 基因型和等位基因型頻率比較 PDE4D基因SNP83位點(diǎn)的CC型純合子基因型頻率與對(duì)照組相比具有顯著差異(P=0.001，OR=1.788;95%CI:1.280～2.497)，提示其與大血管性IS具有顯著相關(guān)性。SNP 219位點(diǎn)AA基因型頻率高于對(duì)照組(P=0.029，OR=1.444;95%CI:1.037 ～2.010)。而其他位點(diǎn)的基因型頻率在病例組和對(duì)照組之間并未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表3。

經(jīng)條件Logistic回歸校正，排除傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素(高血壓、糖尿病、吸煙、高膽固醇血癥等)影響后，SNP83CC基因型分布頻率仍然高于對(duì)照組(P=0.036;OR=1.603;95%CI:1.032～2.489)，SNP219AA基因型分布頻率也仍然高于對(duì)照組(P=0.046;OR=1.567;95%CI:1.008～2.436)。見表4。

表3 病例組與對(duì)照組基因型分布〔n(%)〕

表4 SNP83CC基因型與SNP219AA基因型條件Logistic回歸校正結(jié)果

PDE4D基因SNP83位點(diǎn)C等位基因頻率顯著高于對(duì)照組，當(dāng)個(gè)體攜帶C等位基因時(shí)，其患大血管性IS的風(fēng)險(xiǎn)率增加至1.368倍(OR=1.368;95%CI:1.115～1.678;P=0.003)。SNP219A等位基因頻率顯著高于對(duì)照組，當(dāng)個(gè)體攜帶A等位基因時(shí)，其患大血管性IS的風(fēng)險(xiǎn)率增加至1.228倍(OR=1.228;95%CI:1.001～1.505;P=0.048)，而其他位點(diǎn)等位基因頻率在病例組與對(duì)照組間未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表5。

2.3 病例組與對(duì)照組PDE4D基因單體型頻率比較 本研究分別在PDE4D基因SNP83與SNP87位點(diǎn)之間和SNP219與SNP220位點(diǎn)之間構(gòu)建單體型，應(yīng)用SHEsis軟件計(jì)算各單體型在病例組與對(duì)照組之間的頻率分布，并進(jìn)行比較。結(jié)果顯示:SNP83與 SNP87位點(diǎn)之間組成的單體型(D′=0.641，r2=0.502)在病例組和對(duì)照組的分布頻率并無顯著性差異，而SNP219與SNP220之間構(gòu)建的AA單體型在病例組的頻率分布高于對(duì)照組，GA單體型在對(duì)照組的頻率分布高于病例組(D′=0.707，r2=0.369)。見表6，表7。

表5 病例組與對(duì)照組PDE4D基因等位基因頻率比較〔n(%)〕

表6 病例組與對(duì)照組PDE4D基因單體型頻率(%)比較(SNP83與SNP87)

表7 病例組與對(duì)照組PDE4D基因單體型頻率(%)比較(SNP219與SNP220)

3 討論

IS易感基因的確定是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，單個(gè)基因與IS之間的關(guān)系研究結(jié)論不一。本研究中確定了371例大血管性IS患者和371例健康對(duì)照者的 PDE4D基因 SNP83、SNP87、SNP219和SNP220位點(diǎn)的基因型與等位基因型，分別計(jì)算出了在病例組與對(duì)照組的頻率分布，并進(jìn)行了分析比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)病例組SNP83位點(diǎn)CC基因型、C等位基因型以及SNP219 AA基因型、A等位基因型的分布頻率明顯高于對(duì)照組，這與Saleheen 等〔4～7，11〕的研究結(jié)果一致，提示 SNP83、SNP219 位點(diǎn)可能是我國(guó)北方漢族人群IS的特異性變異位點(diǎn)，是我國(guó)北方漢族人群的易感基因型和易感等位基因型，目前在國(guó)內(nèi)尚無該方面的報(bào)道。而其他位點(diǎn)的基因型與等位基因型的分布頻率在病例組和對(duì)照組間并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這一結(jié)果與Gretarsdottir等〔2〕的結(jié)果不一致。這一差異提示，某種基因多態(tài)性與疾病之間的關(guān)系可能受到地域、種族的影響，不能因?yàn)檫@種基因多態(tài)性在某一國(guó)家或地區(qū)與某種疾病具有或不具有相關(guān)性而輕率作出這種基因是或不是這種疾病的易感基因的論斷，甚至在同一國(guó)家內(nèi)部，也應(yīng)該針對(duì)不同地區(qū)、不同民族的人群進(jìn)行分門別類的研究。

在本研究中，并未發(fā)現(xiàn)在由SNP83、SNP87組成的單體型在病例組和對(duì)照組之間存在分布頻率的差異。推測(cè)其中的原因，一方面可能是因?yàn)榉N族的差異導(dǎo)致了研究結(jié)果的不同。另一方面可能是由于本研究的樣本量有限所致，因此有必要在后續(xù)的研究中繼續(xù)擴(kuò)大研究規(guī)模。不過，在本研究中也發(fā)現(xiàn)，由SNP219與SNP220之間構(gòu)建的AA單體型在病例組的頻率分布高于對(duì)照組，提示其可能是一種危險(xiǎn)性單體型，這種單體型攜帶者罹患大血管性IS的風(fēng)險(xiǎn)可能會(huì)顯著增加;GA單體型在對(duì)照組的頻率分布高于病例組，提示其可能是一種保護(hù)性單體型，這種單體型攜帶者罹患IS的風(fēng)險(xiǎn)可能會(huì)降低。

本研究還分別檢測(cè)了病例組、對(duì)照組中合并高血壓、糖尿病、高膽固醇血癥等傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素以及有吸煙史者的比例，發(fā)現(xiàn)病例組合并高血壓、糖尿病以及有吸煙史者的比例顯著高于對(duì)照組，這與上述因素與IS密切相關(guān)的傳統(tǒng)觀點(diǎn)是一致的。不過，一個(gè)有趣的現(xiàn)象是，病例組中合并高膽固醇血癥者的比例與對(duì)照組人群并無明顯差異，這似乎與傳統(tǒng)觀點(diǎn)相悖。之所以出現(xiàn)這種情況，一方面可能與亞洲人群食品結(jié)構(gòu)中高膽固醇食物含量較少有關(guān)，另一方面也可能與本研究所選擇的樣本量相對(duì)較小有關(guān)。

綜上所述，PDE4D基因SNP83、SNP219位點(diǎn)可能與遼寧省漢族人群大血管性IS具有相關(guān)性，在由SNP219、SNP220位點(diǎn)構(gòu)建的單體型中，AA可能是危險(xiǎn)性單體型，GA可能是保護(hù)性單體型。但還有待大規(guī)模的研究證實(shí)。

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R743

A

1005-9202(2012)12-2508-05;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.12.030

遼寧省教育廳2006～2007年度高等學(xué)?？蒲许?xiàng)目計(jì)劃資助項(xiàng)目(No.20060981)

1 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

何志義(1961-)，男，教授，主任醫(yī)師，主要從事腦血管病基因診治研究。

李 楠(1974-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事腦血管病基因診治研究。

〔2011-11-05收稿 2012-03-10修回〕

(編輯 袁左鳴)