陳 玲 敖 利
(重慶市中醫(yī)院,重慶 400021)
通絡(luò)解毒凝膠劑來(lái)源于重慶市中醫(yī)院名老中醫(yī)的經(jīng)驗(yàn)方,由黃連、馬錢子等中藥組成,臨床應(yīng)用40多年,具有開通經(jīng)絡(luò)、活血鎮(zhèn)痛的功效,其主要有效部位為生物堿類。為進(jìn)一步控制本品的質(zhì)量,本實(shí)驗(yàn)采用反相高效液相色譜法(RP-HPLC法)[1]同時(shí)測(cè)定士的寧和鹽酸小檗堿含量,以保證臨床用藥的安全、有效。
1.1 儀器 HP-1100高效液相色譜儀,包括G1311A四元泵、G1314A可變紫外波長(zhǎng)檢測(cè)器 (美國(guó)安捷倫科技公司);AE-200型電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)。
1.2 試藥 通絡(luò)解毒凝膠劑 (由本院研究部提供,批號(hào)20100504)。 鹽酸 小檗堿 (110713-200609),士的寧(110705-200306)均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供,供含量測(cè)定用。乙腈、甲醇為色譜純,其他均為分析純。
2.1 供試品溶液制備 取不同批次通絡(luò)解毒凝膠劑1.0 g,置100 mL容量瓶中,以甲醇稀釋至刻度,搖勻,取一定量置于5 mL離心管中,以4000 r/min離心5 min,用孔徑為0.2 μm的微孔濾膜濾過(guò)后直接進(jìn)樣。
2.2 線性關(guān)系考察 精密稱取士的寧對(duì)照品0.014 g,鹽酸小檗堿對(duì)照品0.024 g,分別置于50 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,再分別精密吸取 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL,置同一100 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻。精密吸取上述對(duì)照品溶液各20 μL,注入液相色譜儀,分別測(cè)定士的寧和鹽酸小檗堿的峰面積,數(shù)據(jù)以峰面積為橫坐標(biāo),進(jìn)樣量為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果士的寧絕對(duì)進(jìn)樣量在0.056~0.336 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系,回歸方程為:A=2528.7317×C-9.8933 (r=0.9996); 鹽酸小檗堿絕對(duì)進(jìn)樣量在 0.096~0.576 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系,回歸方程為:A=3330.1577×C-11.0256(r=0.9998)。
2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn) 按供試品溶液制備方法,分別制備缺黃連的陰性對(duì)照品和缺馬錢子的陰性對(duì)照品,分別注入液相色譜儀,色譜柱:(phenomenex Luna C18,5 μm,250 mm×4.6 mm);流動(dòng)相:甲醇∶乙腈∶25 mmol/L 磷酸二氫鈉溶液(30∶30∶40);檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm;柱溫:30℃;流量:0.9 mL/min。結(jié)果缺黃連的陰性對(duì)照在鹽酸小檗堿出峰時(shí)間無(wú)色譜峰出現(xiàn);缺馬錢子的陰性對(duì)照在士的寧出峰時(shí)間無(wú)色譜峰出現(xiàn),表明陰性對(duì)照無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。
圖1 高效液相色譜圖
2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取士的寧對(duì)照品溶液20 μL,重復(fù)進(jìn)樣5次,測(cè)定峰面積,其RSD為0.5%,表明儀器精密度良好。
2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取本品正文方法制備供試品溶液,分別于0、2、4、6、8 h進(jìn)樣,測(cè)定士的寧、鹽酸小檗堿的峰面積,其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為0.7%、0.9%,表明供試品溶液至少在8 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品,按擬定的含量測(cè)定方法,分別制備6份供試品溶液,測(cè)定士的寧、鹽酸小檗堿的峰面積,其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD%分別為2.2%、2.6%,說(shuō)明本方法重現(xiàn)性好。
2.7 回收率試驗(yàn) 精密量取本品(士的寧0.55 mg/g,鹽酸小檗堿1.91 mg/g)0.5 g,置100 mL量瓶中,再分別精密加入士的寧對(duì)照品溶液(0.029 mg/mL)8、10、12 mL,鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液(0.100 mg/mL)8、10、12 mL,按擬定的含量測(cè)定方法試驗(yàn),分別測(cè)定士的寧、鹽酸小檗堿的量,按下式計(jì)算回收率(結(jié)果見(jiàn)表1~表2)。結(jié)果表明方法具有良好的回收率。
2.8 樣品含量測(cè)定 取3批本品中試樣品,按正文方法測(cè)定,結(jié)果批號(hào)為20101201、20101202、20101203的樣品中,士的寧含量分別為 0.95、0.92、0.82 mg/mL,平均 0.89 mg/mL;鹽酸小檗堿的含量分別為 2.40、2.27、2.00 mg/mL,平均 2.22 mg/mL。
表1 士的寧回收試驗(yàn)
表2 鹽酸小檗堿回收試驗(yàn)
本試驗(yàn)樣品處理簡(jiǎn)便,經(jīng)反復(fù)進(jìn)樣,柱壓未見(jiàn)明顯上升,柱效未見(jiàn)明顯下降,由于未見(jiàn)提取等操作,不存在中間步驟引入的誤差,方法簡(jiǎn)便,測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確,因此擬定了正文中供試品溶液的制備方法。色譜柱選用了phenomenexLunaC18(5μm,250mm×4.6 mm),Dikma HPLC column(200 mm×4.6 mm,5 μm),兩者峰形都較佳。前者保留時(shí)間適中(10~20 min),后者保留時(shí)間較長(zhǎng)(20 min以后),流動(dòng)相參照藥典和文獻(xiàn)資料[2],對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了篩選,結(jié)果以甲醇-乙腈-25 mmol/L磷酸二氫鈉溶液 (30∶30∶40)能排除陰性及雜質(zhì)峰干擾,士的寧和鹽酸小檗堿均能與相鄰成分達(dá)到基線分離,保留時(shí)間適中,分離度高。檢測(cè)波長(zhǎng)兼顧鹽酸小檗堿和士的寧的最大吸收波長(zhǎng),最后確定為254 nm。
[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010:36,215.
[2] 魯燕俠,崔佳,劉鷹.反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定祛痹丹膠囊中士的寧和馬錢子堿的含量[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志,2001,21(8):1.