文 雯 王 玉

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310053）

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）是發(fā)生于老年和老年前期以各種疾病引起的進(jìn)行性、持續(xù)性高級(jí)神經(jīng)功能的全面障礙，最終導(dǎo)致神經(jīng)功能衰退的一組后天獲得性綜合征，是癡呆中最常見(jiàn)的一種［1］。為進(jìn)一步探討α-細(xì)辛醚和遠(yuǎn)志皂苷配伍的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)體外培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元，并用Aβ25-35體外誘導(dǎo)，建立了AD模型，檢測(cè)用藥前后海馬神經(jīng)元超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量的變化。

1 資料與方法

1.1 試劑及藥物 胰蛋白酶、DMEM高糖培養(yǎng)基、Neurobasal培養(yǎng)液、B27補(bǔ)充物、青霉素、鏈霉素（Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青）；Aβ25-35、多聚賴(lài)氨酸（Sigma）；L-谷氨酰胺（杭州宏博進(jìn)口分裝）；α-細(xì)辛醚標(biāo)準(zhǔn)品 （ALDRICH，2883-98-9）； 腦復(fù)康（石藥集團(tuán)中諾藥業(yè)有限公司，批號(hào)：11100501）；遠(yuǎn)志皂苷標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司，100908A）；阿糖胞苷（上海華聯(lián)制藥廠）。

1.2 大鼠海馬神經(jīng)元的分離培養(yǎng) 取新生24 h內(nèi)的SD大鼠（浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供），在無(wú)菌條件下分離出雙側(cè)海馬，用0.25%胰蛋白酶消化 （37℃、20 min），加入含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基以終止消化，用巴斯德管將組織塊輕輕吹散，制成密度為2×105個(gè)/cm2的單細(xì)胞懸液，接種于涂有多聚賴(lài)氨酸的6孔板上，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。1 d后細(xì)胞貼壁，全部吸棄DMEM培養(yǎng)液，換為完全培養(yǎng)基（Neurobasal培養(yǎng)液加2%B27補(bǔ)充物、0.5 mmol/L L-谷氨酰胺、1%青、鏈霉素組成）。以后每周換液2次，每次換半液。于培養(yǎng)第4日在培養(yǎng)液中加入阿糖胞苷終濃度為10 μmol/L作用48 h以抑制膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度生長(zhǎng)。經(jīng)免疫熒光鑒定，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)器統(tǒng)計(jì)，90%以上的細(xì)胞為神經(jīng)元。培養(yǎng)第10日的神經(jīng)元用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 海馬神經(jīng)元AD模型的建立 選擇Aβ25-35片段，用三蒸水配制成100 μmol/L，過(guò)濾，分裝，-20℃凍存；使用前老化處理（將Aβ25-35溶解在DMSO中，再用DMEM稀釋?zhuān)糜?7℃下孵育7 d，即為老化狀態(tài)），并配制成所需濃度。加入濃度為20 μL（將Aβ25-35溶解在DMSO中，再用DMEM稀釋?zhuān)糜?37℃下孵育 7 d，即為老化狀態(tài)）的 Aβ25-35，接觸 24 h，誘導(dǎo)建立AD細(xì)胞模型。

1.4 分組及與干預(yù) 取AD模型建立成功的神經(jīng)元小皿，隨機(jī)分為模型組、腦復(fù)康組（加入腦復(fù)康注射液，終濃度為50 μmol/L）、α-細(xì)辛醚組（加入α-細(xì)辛醚標(biāo)準(zhǔn)品，終濃度為20 μmol/L）、遠(yuǎn)志皂苷組（加入遠(yuǎn)志皂苷，終濃度為 100 μmol/L），α-細(xì)辛醚聯(lián)合遠(yuǎn)志皂苷組（加入α-細(xì)辛醚標(biāo)準(zhǔn)品終濃度為10 μmol/L、遠(yuǎn)志皂苷終濃度為50 μmol/L）。另設(shè)空白組（正常海馬神經(jīng)元）。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 取造模前后及治療前后海馬神經(jīng)元進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD的含量，細(xì)胞上清液的取樣量為150 μL，檢測(cè)按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，重復(fù)3次；采用硫代巴比妥酸法（TBA）測(cè)定MDA的含量，細(xì)胞上清液的取樣量為0.2 mL，檢測(cè)按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（表示，采用單因素方差分析，再用SNK法進(jìn)行兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Aβ25-35誘導(dǎo)后對(duì)海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的影響 新生大鼠海馬神經(jīng)元分散培養(yǎng)10 d，神經(jīng)元胞體增大，有明顯的折光性，立體感強(qiáng)，多數(shù)呈錐體狀或多極性，神經(jīng)突起相互聯(lián)絡(luò)成網(wǎng)，細(xì)胞已具有成熟神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。經(jīng)Aβ25-35誘導(dǎo)，電鏡觀察部分神經(jīng)元胞體出現(xiàn)腫脹，胞體增大，少數(shù)神經(jīng)元胞體出現(xiàn)空泡，突起淡化、解離，神經(jīng)元纖維呈簇狀。

2.2 石菖蒲、遠(yuǎn)志對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元MDA、SOD的影響 見(jiàn)表1。模型組MDA含量顯著高于空白組，且SOD活力明顯低于空白組（P＜0.05）；腦復(fù)康組、α-細(xì)辛醚組、遠(yuǎn)志皂苷組、α-細(xì)辛醚聯(lián)合遠(yuǎn)志皂苷組MDA含量均低于模型組且SOD活力明顯高于模型組（P＜0.05）；α-細(xì)辛醚聯(lián)合遠(yuǎn)志皂苷組在降低MDA含量及提高SOD活性方面的效果顯著強(qiáng)于二者單用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01）。

表1 各組細(xì)胞上清液中SOD、MDA含量比較（

表1 各組細(xì)胞上清液中SOD、MDA含量比較（

與α-細(xì)辛醚聯(lián)合遠(yuǎn)志皂苷組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組相比，△P＜0.05。

?

3 討 論

石菖蒲為天南星科植物石菖蒲的根莖，其味辛、苦，性微溫，可化痰開(kāi)竅，補(bǔ)五臟、醒神明；遠(yuǎn)志為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志的根，其味苦辛，性微溫，具有寧心安神、祛痰開(kāi)竅之功。石菖蒲常與遠(yuǎn)志配伍以加強(qiáng)化痰開(kāi)竅之功，成為古方治療癡呆、健忘的一個(gè)基本藥對(duì)。藥理學(xué)研究表明，石菖蒲對(duì)多種化學(xué)品造成的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物記憶獲得障礙、記憶鞏固不良、記憶再現(xiàn)缺失、缺氧狀態(tài)均有明顯改善作用。另有研究表明，石菖蒲各提取部位均有促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶作用，但以其總揮發(fā)油中α-細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚的作用最明顯［4］。更有研究運(yùn)用圓二色譜表征Aβ25-35二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果表明石菖蒲水提取液及其揮發(fā)油一定時(shí)間內(nèi)能夠有效地阻止了Aβ25-35由α-螺旋向β-折疊轉(zhuǎn)化，從而減少Aβ25-35的細(xì)胞毒性［5］。遠(yuǎn)志皂苷可顯著拮抗Aβ對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用，它能基本維持細(xì)胞的貼壁狀態(tài)，使漂浮細(xì)胞減少，突起伸展，細(xì)胞的存活數(shù)目較多，乳酸脫氫酶釋放量減少，對(duì)Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷具有較好的保護(hù)作用［6］。

神經(jīng)元受損時(shí)膜電子傳遞鏈的氧化還原狀態(tài)失衡以及AD的病理過(guò)程是產(chǎn)生大量的自由基［1-2］，自由基作用于脂質(zhì)生物膜，使生物膜上的不飽和脂肪酸發(fā)生質(zhì)脂過(guò)氧化反應(yīng)，進(jìn)一步影響膜結(jié)構(gòu)和功能。中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)含有大量的不飽和脂肪酸，易發(fā)生質(zhì)脂過(guò)氧化反應(yīng)，生成大量的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，因而測(cè)定脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的穩(wěn)定代謝物MDA的含量可反映組織自由基的含量和脂質(zhì)過(guò)氧化程度。SOD是一種帶陰性電荷的金屬蛋白酶，是體內(nèi)非常重要的氧自由基清除劑，它通過(guò)歧化方式清除超氧陰離子自由基。神經(jīng)元受損時(shí)導(dǎo)致血-腦屏障開(kāi)放，可使SOD進(jìn)入到內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿和腦組織細(xì)胞外間隙，發(fā)揮清除超氧陰離子的作用。SOD是細(xì)胞內(nèi)主要的對(duì)抗氧自由基的酶促抗氧化防御系統(tǒng)，SOD能使氧自由基在生理pH環(huán)境轉(zhuǎn)化成O2和H2O，脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)產(chǎn)物的增加可由自由基產(chǎn)生過(guò)多或其清除系統(tǒng)功能的喪失引起。

本實(shí)驗(yàn)利用體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元經(jīng)Aβ25-35誘導(dǎo)成功建立AD模型，體外模擬老年癡呆細(xì)胞損傷模型，檢測(cè)SOD、MDA含量。結(jié)果提示，過(guò)氧化反應(yīng)增強(qiáng)是導(dǎo)致老化反應(yīng)的重要因素；α-細(xì)辛醚和遠(yuǎn)志皂苷均可明顯提高SOD活性和降低MDA含量，且α-細(xì)辛醚與遠(yuǎn)志皂苷合用的效果明顯優(yōu)于二者單用，說(shuō)明α-細(xì)辛醚和遠(yuǎn)志皂苷在清除自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化方面具有協(xié)同作用，為二者在臨床上常相合為用提供了體外培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］ Nicoll JA，Wilkinson D，Holmes C，et al.Neuropathology of human Alzheimer disease after immunization with amyloid-beta peptide：a case report［J］.Nature Medicine，2003，9：448-452.

［2］ Hook VY，Reisine TD.Cysteine proteases are the major beta-secretase in the regulated secretory pathway that provides most of the betaamyloid in Alzheimer’s disease：role of BACE 1 in the constitutive secretory pathway［J］.J Neurosci Res， 2003，74(3)：393-405.

［3］ Kawahara M，Kuroda Y.Molecular mechanism of neurodegeneration induced by Alzheimer’s beta-amyloid protein： channel formation and disruption of calcium homeostasis［J］.Brain Res Bull，2000，53：389-397.

［4］ Lin H.Amyloid beta protein forms ion channels：implications for Alzheimer’s disease pathophysiology［J］.FASEB J，2001，15：2433-2445.

［5］ Troy CM，Rabacchi SA，F(xiàn)riedman WJ，et al.Caspase-2 mediates neuronal cell death induced by beta-amyloid［J］.J Neurosci，2000，20(4)：1386-1392.

［6］ Tsuruda T，Costelloboerrigter LC，Burnett Jr JC.Matrix metalloproteinases： pathways of induction by bioactive molecules［J］.Heart Fail Rev，2004，9(1)：53-61.