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        Aβ25-35體外誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元及石菖蒲、遠志有效成分合用對其SOD、MDA的影響*

        2012-01-31 08:14:16
        中國中醫(yī)急癥 2012年8期
        關(guān)鍵詞:遠志石菖蒲過氧化

        文 雯 王 玉

        (浙江中醫(yī)藥大學(xué)生物工程學(xué)院,浙江 杭州 310053)

        阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease,AD)是發(fā)生于老年和老年前期以各種疾病引起的進行性、持續(xù)性高級神經(jīng)功能的全面障礙,最終導(dǎo)致神經(jīng)功能衰退的一組后天獲得性綜合征,是癡呆中最常見的一種[1]。為進一步探討α-細辛醚和遠志皂苷配伍的作用機制,本實驗體外培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元,并用Aβ25-35體外誘導(dǎo),建立了AD模型,檢測用藥前后海馬神經(jīng)元超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量的變化。

        1 資料與方法

        1.1 試劑及藥物 胰蛋白酶、DMEM高糖培養(yǎng)基、Neurobasal培養(yǎng)液、B27補充物、青霉素、鏈霉素(Gibco公司);胎牛血清(杭州四季青);Aβ25-35、多聚賴氨酸(Sigma);L-谷氨酰胺(杭州宏博進口分裝);α-細辛醚標(biāo)準(zhǔn)品 (ALDRICH,2883-98-9); 腦復(fù)康(石藥集團中諾藥業(yè)有限公司,批號:11100501);遠志皂苷標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物科技有限公司,100908A);阿糖胞苷(上海華聯(lián)制藥廠)。

        1.2 大鼠海馬神經(jīng)元的分離培養(yǎng) 取新生24 h內(nèi)的SD大鼠(浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供),在無菌條件下分離出雙側(cè)海馬,用0.25%胰蛋白酶消化 (37℃、20 min),加入含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基以終止消化,用巴斯德管將組織塊輕輕吹散,制成密度為2×105個/cm2的單細胞懸液,接種于涂有多聚賴氨酸的6孔板上,置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。1 d后細胞貼壁,全部吸棄DMEM培養(yǎng)液,換為完全培養(yǎng)基(Neurobasal培養(yǎng)液加2%B27補充物、0.5 mmol/L L-谷氨酰胺、1%青、鏈霉素組成)。以后每周換液2次,每次換半液。于培養(yǎng)第4日在培養(yǎng)液中加入阿糖胞苷終濃度為10 μmol/L作用48 h以抑制膠質(zhì)細胞的過度生長。經(jīng)免疫熒光鑒定,通過細胞計數(shù)器統(tǒng)計,90%以上的細胞為神經(jīng)元。培養(yǎng)第10日的神經(jīng)元用于實驗。

        1.3 海馬神經(jīng)元AD模型的建立 選擇Aβ25-35片段,用三蒸水配制成100 μmol/L,過濾,分裝,-20℃凍存;使用前老化處理(將Aβ25-35溶解在DMSO中,再用DMEM稀釋,置于37℃下孵育7 d,即為老化狀態(tài)),并配制成所需濃度。加入濃度為20 μL(將Aβ25-35溶解在DMSO中,再用DMEM稀釋,置于 37℃下孵育 7 d,即為老化狀態(tài))的 Aβ25-35,接觸 24 h,誘導(dǎo)建立AD細胞模型。

        1.4 分組及與干預(yù) 取AD模型建立成功的神經(jīng)元小皿,隨機分為模型組、腦復(fù)康組(加入腦復(fù)康注射液,終濃度為50 μmol/L)、α-細辛醚組(加入α-細辛醚標(biāo)準(zhǔn)品,終濃度為20 μmol/L)、遠志皂苷組(加入遠志皂苷,終濃度為 100 μmol/L),α-細辛醚聯(lián)合遠志皂苷組(加入α-細辛醚標(biāo)準(zhǔn)品終濃度為10 μmol/L、遠志皂苷終濃度為50 μmol/L)。另設(shè)空白組(正常海馬神經(jīng)元)。

        1.5 標(biāo)本采集與檢測 取造模前后及治療前后海馬神經(jīng)元進行形態(tài)學(xué)觀察。采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD的含量,細胞上清液的取樣量為150 μL,檢測按試劑盒說明書操作,重復(fù)3次;采用硫代巴比妥酸法(TBA)測定MDA的含量,細胞上清液的取樣量為0.2 mL,檢測按試劑盒說明書操作,重復(fù)3次。

        1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計軟件。計量資料以(表示,采用單因素方差分析,再用SNK法進行兩兩比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié) 果

        2.1 Aβ25-35誘導(dǎo)后對海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的影響 新生大鼠海馬神經(jīng)元分散培養(yǎng)10 d,神經(jīng)元胞體增大,有明顯的折光性,立體感強,多數(shù)呈錐體狀或多極性,神經(jīng)突起相互聯(lián)絡(luò)成網(wǎng),細胞已具有成熟神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)特點。經(jīng)Aβ25-35誘導(dǎo),電鏡觀察部分神經(jīng)元胞體出現(xiàn)腫脹,胞體增大,少數(shù)神經(jīng)元胞體出現(xiàn)空泡,突起淡化、解離,神經(jīng)元纖維呈簇狀。

        2.2 石菖蒲、遠志對Aβ25-35誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元MDA、SOD的影響 見表1。模型組MDA含量顯著高于空白組,且SOD活力明顯低于空白組(P<0.05);腦復(fù)康組、α-細辛醚組、遠志皂苷組、α-細辛醚聯(lián)合遠志皂苷組MDA含量均低于模型組且SOD活力明顯高于模型組(P<0.05);α-細辛醚聯(lián)合遠志皂苷組在降低MDA含量及提高SOD活性方面的效果顯著強于二者單用,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或0.01)。

        表1 各組細胞上清液中SOD、MDA含量比較(

        表1 各組細胞上清液中SOD、MDA含量比較(

        與α-細辛醚聯(lián)合遠志皂苷組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型組相比,△P<0.05。

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        3 討 論

        石菖蒲為天南星科植物石菖蒲的根莖,其味辛、苦,性微溫,可化痰開竅,補五臟、醒神明;遠志為遠志科植物遠志的根,其味苦辛,性微溫,具有寧心安神、祛痰開竅之功。石菖蒲常與遠志配伍以加強化痰開竅之功,成為古方治療癡呆、健忘的一個基本藥對。藥理學(xué)研究表明,石菖蒲對多種化學(xué)品造成的實驗動物記憶獲得障礙、記憶鞏固不良、記憶再現(xiàn)缺失、缺氧狀態(tài)均有明顯改善作用。另有研究表明,石菖蒲各提取部位均有促進學(xué)習(xí)記憶作用,但以其總揮發(fā)油中α-細辛醚和β-細辛醚的作用最明顯[4]。更有研究運用圓二色譜表征Aβ25-35二級結(jié)構(gòu)的變化,結(jié)果表明石菖蒲水提取液及其揮發(fā)油一定時間內(nèi)能夠有效地阻止了Aβ25-35由α-螺旋向β-折疊轉(zhuǎn)化,從而減少Aβ25-35的細胞毒性[5]。遠志皂苷可顯著拮抗Aβ對神經(jīng)細胞的毒性作用,它能基本維持細胞的貼壁狀態(tài),使漂浮細胞減少,突起伸展,細胞的存活數(shù)目較多,乳酸脫氫酶釋放量減少,對Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞損傷具有較好的保護作用[6]。

        神經(jīng)元受損時膜電子傳遞鏈的氧化還原狀態(tài)失衡以及AD的病理過程是產(chǎn)生大量的自由基[1-2],自由基作用于脂質(zhì)生物膜,使生物膜上的不飽和脂肪酸發(fā)生質(zhì)脂過氧化反應(yīng),進一步影響膜結(jié)構(gòu)和功能。中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)含有大量的不飽和脂肪酸,易發(fā)生質(zhì)脂過氧化反應(yīng),生成大量的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物,因而測定脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的穩(wěn)定代謝物MDA的含量可反映組織自由基的含量和脂質(zhì)過氧化程度。SOD是一種帶陰性電荷的金屬蛋白酶,是體內(nèi)非常重要的氧自由基清除劑,它通過歧化方式清除超氧陰離子自由基。神經(jīng)元受損時導(dǎo)致血-腦屏障開放,可使SOD進入到內(nèi)皮細胞的胞漿和腦組織細胞外間隙,發(fā)揮清除超氧陰離子的作用。SOD是細胞內(nèi)主要的對抗氧自由基的酶促抗氧化防御系統(tǒng),SOD能使氧自由基在生理pH環(huán)境轉(zhuǎn)化成O2和H2O,脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物的增加可由自由基產(chǎn)生過多或其清除系統(tǒng)功能的喪失引起。

        本實驗利用體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元經(jīng)Aβ25-35誘導(dǎo)成功建立AD模型,體外模擬老年癡呆細胞損傷模型,檢測SOD、MDA含量。結(jié)果提示,過氧化反應(yīng)增強是導(dǎo)致老化反應(yīng)的重要因素;α-細辛醚和遠志皂苷均可明顯提高SOD活性和降低MDA含量,且α-細辛醚與遠志皂苷合用的效果明顯優(yōu)于二者單用,說明α-細辛醚和遠志皂苷在清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化方面具有協(xié)同作用,為二者在臨床上常相合為用提供了體外培養(yǎng)的實驗依據(jù)。

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