劉杰民 藺曉源 王 敏 紀(jì)云西

（1.貴州省人民醫(yī)院，貴州 貴陽 550002；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410007；3.貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550001；4.廣西中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023）

中晚期胃癌占整個(gè)胃癌發(fā)病率的60%～80%［1］，臨床治療頗為棘手。貴州省已故名老中醫(yī)陳慈煦教授運(yùn)用通降解毒方治療中晚期胃癌取得了較好的臨床效果［2］。為深入研究該方的作用機(jī)制，本研究采用通降解毒方藥物血清，觀察其對胃癌細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡SD大鼠12只，雄性，體質(zhì)量 （350±20）g，SPF級(jí)，購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 細(xì)胞株 胃癌MKN-45細(xì)胞株由上海第二軍醫(yī)大學(xué)饋贈(zèng)，細(xì)胞培養(yǎng)液為含10%胎牛血清、100 U／mL青霉素和100 ttg／mL鏈霉素的RPMI1640溶液。

1.3 藥物 通降解毒方主要由旋覆花、代赭石、法半夏、云茯苓、陳皮、瓜蔞皮、薤白、丹參、桃仁、紅花、火麻仁、蜈蚣、守宮、蚤休、白花蛇舌草、半枝蓮等組成，由貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院提供。按人-大鼠體質(zhì)量換算比計(jì)算出大鼠用藥的臨床等效劑量。5-Aza-CdR由Sigma公司提供。

1.4 主要試劑與儀器 RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清，聚丙烯酸（PAA）；細(xì)胞活性計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit 8，CCK8），日本同仁化學(xué)研究所公司產(chǎn)品。二氧化碳培養(yǎng)箱 （美國Sheldon公司），直徑0.22 μm過濾器（上海普飛生物技術(shù)有限公司），96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Costar公司），離心機(jī)（Thermo公司），倒置相差顯微鏡（日本 Olympus公司，CK2型），酶標(biāo)儀（美國Stat公司，F(xiàn)ax-2100型）。

1.5 藥物血清制備 12只SD大鼠隨機(jī)分成0.9%氯化鈉注射液組、通降解毒方組，每組6只。通降解毒方組給予水煎劑（含生藥量3.1 g/mL），0.9%氯化鈉注射液組給予0.9%氯化鈉注射液。每次灌胃2 mL，每日2次，連續(xù)4 d。第5日晨灌4 mL，1 h后于SD大鼠股動(dòng)脈處活體取血。全血靜置3 h后，3000 r/min，收集血清，56℃水浴滅活補(bǔ)體30 min，經(jīng)0.22 μm的過濾膜過濾滅菌，分別制成空白血清和通降解毒方藥物血清，置于-70℃保存。

1.6 藥物血清干預(yù) 胃癌MKN-45細(xì)胞置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，用胰酶消化2 min，然后收集細(xì)胞。將消化好的細(xì)胞調(diào)整計(jì)數(shù)為 1×104個(gè)／mL，每孔 100 μL，接種在 96孔板，加入無血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后，改用正常培養(yǎng)液培養(yǎng)。采用信封法將細(xì)胞隨機(jī)分成4組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔：空白對照組不處理，空白血清組每孔加入20 μL空白血清，通降解毒方血清組每孔加入20 μL藥物血清，5-Aza-CdR組每孔加入 20 μL 5 μmol/L 的 5-Aza-CdR。 各組分別培養(yǎng) 24、48、72 h。

1.7 胃癌細(xì)胞MKN-45形態(tài)的觀察 各組MKN-45胃癌細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)間點(diǎn)，棄去上清液，PBS反復(fù)洗滌2次，于倒置相差顯微鏡下觀察MKN-45細(xì)胞形態(tài)的變化。

1.8 CCK8檢測胃癌細(xì)胞MKN-45的增殖［3］各組MKN-45胃癌細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)間點(diǎn)，棄去上清液，用PBS反復(fù)洗滌2次，每孔加入CCK8溶液10 μL，于酶標(biāo)儀450 nm波長處檢測各孔吸光度。并設(shè)一空白調(diào)零組，該組不含細(xì)胞，僅加入同等濃度的CCK8溶液和無藥物血清的培養(yǎng)液。重復(fù)3次，然后計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0軟件統(tǒng)計(jì)。定性指標(biāo)以百分率或構(gòu)成比描述；計(jì)量資料以表示。兩組對比分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組胃癌細(xì)胞MKN-45形態(tài)的變化 在顯微鏡下觀察，藥物血清和5-Aza-CdR干預(yù)72 h后，可見細(xì)胞發(fā)生脫落、變圓，細(xì)胞璧邊緣毛糙等形態(tài)學(xué)變化，細(xì)胞折光度也下降，細(xì)胞核內(nèi)可見黑色顆粒。

2.2 各組胃癌細(xì)胞MKN-45治療前后增殖率比較 見表1?？瞻籽褰M和空白對照組細(xì)胞增殖率相比無明顯差別。與空白對照組相比，經(jīng)過通降解毒含藥血清及5-Aza-CdR作用24、48、72 h后，胃癌細(xì)胞增殖率明顯降低（P＜0.05）。

3 討 論

胃癌屬中醫(yī)學(xué)“胃脘痛”、“癥瘕”、“積聚”等范疇，由于飲食不節(jié)、情志不遂、正氣內(nèi)虛等多種因素雜合而致。飲食不節(jié)則積熱耗陰，津液乏運(yùn)，郁而化痰；情志不遂則肝郁氣滯，氣滯血瘀。痰、氣、瘀交阻化熱，聚成癌毒停積胃脘。日久正氣不足，驅(qū)邪無力，邪毒日盛。邪毒益甚，氣滯更深，痰瘀膠著，胃納銳減，甚或斷谷，終成“虛、痰、毒、瘀”的復(fù)雜病理過程。陳老深諳其道，立以通（理氣、化痰、行瘀、通腑）降（降逆）解毒之法，擬用通降解毒方。方中旋覆花、代赭石、法半夏用以降逆；陳皮、云茯苓、瓜蔞皮、薤白化痰利竅，消痞散結(jié)；桃仁、紅花、丹參活血行瘀；蚤休、蜈蚣、守宮、白花蛇舌草、半枝蓮解毒抗癌；火麻仁潤下通降。充分體現(xiàn)了“通降解毒”的基本法則。全方配伍精當(dāng)，攻邪不傷正，通以使降，降以助通，解毒以削毒力，假通降而祛邪下行［2］。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胃癌MKN-45細(xì)胞經(jīng)通降解毒含藥血清作用后形態(tài)發(fā)生明顯變化，CCK8法測定胃癌細(xì)胞增殖率明顯下降，與空白對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。此研究結(jié)果從體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)了通降解毒方能抑制腫瘤的生長，表明其具有抗腫瘤的作用。

表1 各組胃癌細(xì)胞MKN-45治療前后吸光度值及增殖率比較（%

表1 各組胃癌細(xì)胞MKN-45治療前后吸光度值及增殖率比較（%

與空白對照組比較，△P＜0.05。

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［1］ 邱國欽，許麗貞，林智才，等.替吉奧治療老年進(jìn)展期胃癌的臨床觀察［J］.中國腫瘤臨床與康復(fù)，2011，18（1）：61-63.

［2］ 陳繼婷，翟信長，易玉斌.陳慈煦教授用通降解毒法治療食道癌、胃癌臨床經(jīng)驗(yàn)淺析［J］.貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1995，17（3）：17.

［3］ 桂牧微，魏品康，陸燁，等.消痰散結(jié)方藥物血清對人胃癌MKN-45細(xì)胞增殖和凋亡的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2010，8（3）：250-255.