譚文瀾 歐陽升 陸 暉 張永全△

（1.廣西中醫(yī)學(xué)院附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011；2.湖南省郴州市第一人民醫(yī)院，湖南 郴州423000）

癲癇發(fā)作后腦神經(jīng)元有大量凋亡現(xiàn)象出現(xiàn)，因此普遍認(rèn)為凋亡是癲癇后腦神經(jīng)元死亡的一種形式［1-2］。細(xì)胞凋亡的發(fā)生是由基因調(diào)控的，其中Bcl-2為重要的抗細(xì)胞凋亡基因。本實驗觀察戊四氮（PTZ）誘導(dǎo)急性癲癇形成過程中海馬區(qū)Bcl-2基因編碼的蛋白表達(dá)變化，以及抗癇煎劑對其的影響作用。

1 材料與方法

1.1 材料 成年雄性60只清潔級SD大鼠，體質(zhì)量180~230 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。PTZ由美國Sigma公司生產(chǎn)；丙戊酸鈉，購自湖南湘中制藥有限公司。抗癇煎劑（石菖蒲10 g，三七 10 g，天麻 10 g，鉤藤 10 g，地龍 10 g 等藥組成），由廣西中醫(yī)學(xué)院附屬瑞康醫(yī)院提供。

1.2 模型制備 隨機(jī)選出10只大鼠作為正常對照組，其余50只用PTZ 55 mg/kg腹腔注射造成大鼠急性癇性發(fā)作模型，模型成功與否以其發(fā)作時的行為變化為主要依據(jù)，按Racine分級［3］：0級：無任何反應(yīng)；1級：面部陣攣，包括眨眼、動須、節(jié)奏性咀嚼等；2級：1級加節(jié)律性點頭；3級：2級加前肢陣攣；4級：3級加后肢站立；5級：4級加摔倒。達(dá)到4～5級的大鼠選用，未達(dá)到4級的大鼠淘汰。正常對照組給予同等體積0.9%氯化鈉注射液腹腔注射。

1.3 分組與給藥 選取造模成功的40只SD大鼠，隨機(jī)分為4組，每組各10只，于造模成功后的第2日開始給藥：模型組灌胃0.9%氯化鈉注射液，每日2 mL/kg；抗癇煎劑低劑量組灌胃抗癇煎劑 5 g/（kg·d）；抗癇煎劑高劑量組灌胃抗癇煎劑10 g/（kg·d）；丙戊酸鈉組灌胃丙戊酸鈉 90 mg/（kg·d）。 正常對照組灌胃0.9%氯化鈉注射液，每日2 mL/kg。連續(xù)給藥7 d。

1.4 行為學(xué)觀察 給藥結(jié)束后次日，模型組、抗癇煎劑高、低劑量組及丙戊酸鈉組再予PTZ 55 mg/kg腹腔注射，正常對照組腹腔注射等量0.9%氯化鈉注射液，然后觀察大鼠癇性發(fā)作的潛伏期（即給藥到首次發(fā)作的時間）。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 于行為學(xué)觀察24 h后大鼠腹腔注射10%水合氯醛4 mL/kg進(jìn)行麻醉，麻醉成功后，開胸暴露心臟，經(jīng)左心室穿刺至主動脈插管，同時剪開右心耳，先以4℃ 0.9%氯化鈉注射液100 mL快速沖管，待右心耳流出的液體基本無血色后，繼以4%多聚甲醛-0.1 mol/L PB液灌注，首先快速灌注，至大鼠四肢肌肉抽搐停止，然后改為緩慢灌注，至大鼠軀干、四肢、尾巴僵硬，肝臟質(zhì)地僵硬變白。每只大鼠灌注時間持續(xù)約30 min左右。然后斷頭取腦組，將含有海馬的腦組織塊放入4%中性甲醛中4 h后取出，放入20%的蔗糖中過夜，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、石蠟切片，片厚10 μm。每只大鼠隨機(jī)抽取2張切片，作免疫組化染色。每張切片隨機(jī)選取5個完整而不重疊的高倍鏡視野（×400），同一光強度下，計數(shù)每個高倍鏡視野下Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)，然后求其平均細(xì)胞個數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 抗癇煎劑對PTZ致癇大鼠癇性發(fā)作的影響 正常對照組腹腔注射0.9%氯化鈉注射液后，無1例出現(xiàn)癲癇發(fā)作，一般情況無明顯變化，行為同正常大鼠。其余各組動物腹腔注射PTZ后，其癇性發(fā)作的潛伏期具體情況見表1。其中，模型組動物平均約1 min發(fā)作，多數(shù)先表現(xiàn)為凝視，緊接著出現(xiàn)點頭運動（Ⅱ級），繼之出現(xiàn)雙前肢抬起作陣攣運動（Ⅲ級）、后肢伸直（Ⅳ級），最終身體歪向一側(cè)而出現(xiàn)翻滾、跌倒（Ⅴ級）。大部分動物Ⅴ級發(fā)作持續(xù)數(shù)十秒后能自行緩解，其后表現(xiàn)為Ⅱ~Ⅳ級反復(fù)發(fā)作。也有部分動物直接由Ⅱ級發(fā)展為Ⅴ級。模型組有1只大鼠因癲癇持續(xù)狀態(tài)而死亡。抗癇煎劑高劑量組、丙戊酸鈉組與模型組比較，其潛伏期明顯延長，差異明顯（P＜0.05），而抗癇煎劑高劑量組與丙戊酸鈉組之間，抗癇煎劑低劑量組與模型組之間相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠驚厥潛伏期比較（s

表1 各組大鼠驚厥潛伏期比較（s

與模型組比較，*P＜0.05。下同。

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2.2 抗癇煎劑對戊四氮致癇大鼠Bcl-2蛋白表達(dá)的影響 見表2。正常對照組海馬神經(jīng)元CA1、CA3區(qū)偶見一些弱染的、散在的Bcl-2陽性細(xì)胞；模型組Bcl-2陽性細(xì)胞較少，陽性細(xì)胞著色和密度均有增強；經(jīng)藥物預(yù)處理的抗癇煎劑低、高劑量組和丙戊酸鈉組，海馬神經(jīng)元存在較多量的Bcl-2陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞著色和密度均較正常對照組及模型組增強。結(jié)果顯示：正常對照組中Bcl-2蛋白染色陽性細(xì)胞低表達(dá)，與其余各組相比，差異明顯（P＜0.01）；抗癇煎劑高、低劑量組及丙戊酸鈉組Bcl-2蛋白染色陽性細(xì)胞增多，與模型組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)比較

表2 各組大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)比較

與正常對照組比較，△P＜0.01。

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3 討 論

近年研究證實，癲癇發(fā)作可導(dǎo)致海馬、杏仁核、大腦皮質(zhì)、丘腦、小腦等部位神經(jīng)元喪失［4］。無論是癲癇持續(xù)狀態(tài)、還是單次或者反復(fù)的癲癇發(fā)作，神經(jīng)元的異常放電都可以誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。細(xì)胞凋亡與許多基因的表達(dá)密切相關(guān)，有促進(jìn)凋亡的基因，也有些基因的表達(dá)可以使細(xì)胞抗凋亡能力增強，目前并沒有發(fā)現(xiàn)單一的死亡基因，而是一系列基因的表達(dá)及相互作用，造成細(xì)胞生存與死亡。近年來的研究顯示，Bcl-2、P53、Bax等細(xì)胞凋亡基因表達(dá)蛋白在癇性腦損傷中有重要作用［5］。研究表明Bcl-2基因在細(xì)胞凋亡中起重要的調(diào)控作用［6］。癲癇誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡是由半胱氨酸水解酶家族的級聯(lián)激活和降解作用引起的，目前對癲癇發(fā)作導(dǎo)致神經(jīng)元損傷的分子機(jī)制研究主要集中在內(nèi)源性途徑，即細(xì)胞凋亡的線粒體途徑。當(dāng)線粒體外膜通透性發(fā)生改變時，細(xì)胞色素C釋放并激活caspase-9，后者是細(xì)胞凋亡線粒體通路的重要啟動酶，繼而進(jìn)一步活化下游的效應(yīng)酶caspase-3。一旦CytoC釋放，caspase級聯(lián)激活，神經(jīng)元凋亡的命運即難以逆轉(zhuǎn)［7］。Bcl-2家族蛋白是整合細(xì)胞線粒體刺激信號的關(guān)鍵，是線粒體前主要的調(diào)控因子，直接決定著線粒體通透性的變化［7］。Bcl-2蛋白的生理功能主要是抑制細(xì)胞凋亡，延長細(xì)胞壽命，而不影響細(xì)胞周期和分化。

抗癇煎劑為筆者所在科室多年應(yīng)用于抗癲癇的協(xié)定處方?？拱B煎劑方中石菖蒲豁痰開竅醒腦為君藥，三七活血化瘀，治久病瘀血入絡(luò)為臣藥，天麻、鉤藤息風(fēng)止痙為佐藥，地龍通絡(luò)為使藥。此方經(jīng)臨床應(yīng)用具用較好療效［7-8］，且已有實驗證實：抗癇煎劑能提高小白鼠電致驚厥閾和抑制電刺激反應(yīng)性，有較好的抗驚厥作用［9］。

本實驗顯示，抗癇煎劑高劑量組和丙戊酸鈉組在發(fā)作潛伏期較模型組明顯延長，高劑量組與丙戊酸鈉組相比無顯著差異（P＞0.05）；正常對照組海馬神經(jīng)元Bcl-2陽性細(xì)胞為少量的弱染色的、散在的細(xì)胞；模型組與正常對照組比較海馬神經(jīng)元CA1、CA3區(qū)的Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)量增加、染色稍增深，說明了Bcl-2參與了癲癇海馬區(qū)神經(jīng)元的凋亡過程；各藥物干預(yù)組量的海馬神經(jīng)元Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)量比模型組增加、染色增深。說明藥物組能通過增加Bcl-2的表達(dá)來抑制細(xì)胞凋亡，實現(xiàn)其神經(jīng)保護(hù)作用。而抗癇煎劑高劑量組陽性細(xì)胞數(shù)較之低劑量組增加，說明抗癇煎劑的劑量對抗癇作用有很大影響。

由此可見，抗癇煎劑可能是通過促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá)而實現(xiàn)抗細(xì)胞凋亡作用，其對癇性發(fā)作后神經(jīng)元凋亡具有一定的保護(hù)作用。

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