王勝樂，王鐵成，馮 娜，李元果，于志君，丁 潔，許薇薇，忻 悅，岳秀芳，王 錚，鄭學(xué)星，楊松濤，黃 耕，趙永坤，高玉偉，夏咸柱

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130062；2.中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，長(zhǎng)春 130062；

3.吉林省人畜共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130062)

水貂犬瘟熱動(dòng)物模型的建立

王勝樂1，2，3，王鐵成2，3，馮 娜1，2，3，李元果2，于志君2，丁 潔2，許薇薇2，忻 悅2，岳秀芳2，王 錚2，鄭學(xué)星2，3，楊松濤2，3，黃 耕2，3，趙永坤2，3，高玉偉2，3，夏咸柱2，3

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130062；2.中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，長(zhǎng)春 130062；

3.吉林省人畜共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130062)

目的 建立水貂犬瘟熱動(dòng)物模型，并利用水貂犬瘟熱模型評(píng)價(jià)不同犬瘟熱強(qiáng)毒株的毒力，為水貂犬瘟熱病毒疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。方法 從猴、藏獒、犬的病料中分離犬瘟熱病毒，測(cè)定犬瘟熱病毒的毒力，并進(jìn)行傳代培養(yǎng)。利用犬的犬瘟熱動(dòng)物模型篩選穩(wěn)定的犬瘟熱強(qiáng)毒株，進(jìn)行水貂犬瘟熱動(dòng)物模型的建立及其毒力評(píng)估。結(jié)果 篩選出了穩(wěn)定的犬瘟熱強(qiáng)毒株并進(jìn)行了家犬動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，同時(shí)表現(xiàn)出了強(qiáng)烈的臨床癥狀，并利用不同的代次毒進(jìn)行了犬瘟熱動(dòng)物模型的建立。結(jié)論 成功建立了犬瘟熱動(dòng)物模型并對(duì)不同來源的犬瘟熱病毒毒力進(jìn)行了評(píng)估。

水貂；模型，動(dòng)物；毒力評(píng)估；大瘟熱病毒

犬瘟熱病毒屬于副粘病毒科麻疹病毒屬RNA病毒成員。水貂犬瘟熱又稱貂瘟，是一種嚴(yán)重危害水貂養(yǎng)殖的烈性傳染性疾病。水貂犬瘟熱呈現(xiàn)慢性或急性經(jīng)過，慢性型的病程通常為2～4周，急性型的病程為3～10d，主要表現(xiàn)為眼和鼻內(nèi)排出粘稠分泌物，有時(shí)會(huì)阻塞眼、鼻，體溫升高至40℃以上。當(dāng)貂群中感染犬瘟熱病毒，經(jīng)3～4周即可在貂群中廣泛傳播，癥狀嚴(yán)重，死亡率較高，有時(shí)可達(dá)80%～90%，對(duì)2～4月齡幼貂感染更為嚴(yán)重［1］。隨著水貂做為一種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物在我國(guó)集約化養(yǎng)殖范圍越來越廣，規(guī)模逐漸擴(kuò)大，一旦在貂場(chǎng)發(fā)生該病感染，很難治愈，同時(shí)發(fā)生犬瘟熱時(shí)會(huì)繼發(fā)細(xì)菌感染，為本病的治療又帶來了巨大困難，會(huì)給貂場(chǎng)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［2］。

應(yīng)用疫苗可以較好的的預(yù)防犬瘟熱病毒［3］，犬瘟熱疫苗在犬等動(dòng)物中取得較為滿意的預(yù)防效果，但在水貂中因缺少水貂動(dòng)物模型［4］，犬瘟熱疫苗在水貂中起到預(yù)防作用還不完全明確，為此，本試驗(yàn)通過建立水貂犬瘟熱動(dòng)物模型，并對(duì)毒力進(jìn)行評(píng)估，為水貂犬瘟熱疫苗的研究提供理論和技術(shù)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞、毒株及試驗(yàn)動(dòng)物

細(xì)胞、毒株：Dog-DST細(xì)胞，犬瘟熱強(qiáng)毒株：猴源犬瘟熱(monkey-CDV)、藏獒源犬瘟熱(ZACDV)、黑川犬源犬瘟熱病毒(HC-CDV)由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和保存。試驗(yàn)動(dòng)物：2～3月齡水貂 購(gòu)自長(zhǎng)春某水貂場(chǎng)。

1.2 主要試劑

抗CDV單克隆抗體 6H8由本實(shí)驗(yàn)室制備；DMEM(HyClone)；G418(Sigma公司)；新生犢牛血清(長(zhǎng)春西諾生物科技有限公司)。青霉素、鏈霉素(華聯(lián)醫(yī)藥有限公司)；犬瘟熱診斷試劑盒，購(gòu)自韓國(guó)BIT產(chǎn)品。

1.3 主要儀器設(shè)備

HEMAVET 950FS型血液五分類分析儀；電子顯微鏡(JEM-1200EXⅡ型，日本)；XDS-1B倒置顯微鏡(中國(guó)上海)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)；高速冷凍離心機(jī)(Centrifuge 5418，Eppendorf)；生物安全柜(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)；電子天秤(Sartorious)；Tissuelyser II 型 組 織 研 磨 器(QIAGEN)；制冰機(jī)(常熟市雪科電器有限公司)；冰箱(Siemens)。

1.4 試驗(yàn)動(dòng)物的選擇

試驗(yàn)前分別采集水貂血液，分離血清，并進(jìn)行初步處理(各血清樣本56℃滅活30min，分別加青、鏈霉素4℃ 12h)，進(jìn)行中和試驗(yàn)［5-6］，選用血清犬瘟熱中和抗體效價(jià)小于1∶8的水貂進(jìn)行試驗(yàn)。

1.5 犬瘟熱毒株毒力測(cè)定

將分離培養(yǎng)穩(wěn)定的犬瘟熱病毒用無血清的細(xì)胞培養(yǎng)液按10倍連續(xù)稀釋10-1、10-2……10-6，每個(gè)稀釋度接種4個(gè)孔，每孔0.1mL，再于各孔中加入50μL Vero-DST細(xì)胞懸液，最后2列加細(xì)胞培養(yǎng)液，作為Vero細(xì)胞對(duì)照。置于5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，記錄細(xì)胞出現(xiàn)CPE，5d后，按Reed-Muench方法計(jì)算各毒株的TCID50，選病毒滴度為104TCID50/m L以上的犬瘟熱毒株進(jìn)行試驗(yàn)［7］。

1.6 犬瘟熱病毒對(duì)水貂的攻毒試驗(yàn)及臨床癥狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

犬瘟熱病毒對(duì)水貂的攻毒試驗(yàn)：為檢測(cè)犬瘟熱各毒株對(duì)水貂感染情況，進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，試驗(yàn)共分4組，第1組為對(duì)照組，其他各組為犬瘟熱攻毒組，見表1。隔天采血，每天測(cè)量體溫、收集糞便、鼻洗液、咽拭子及眼拭子，并用犬瘟熱診斷試劑盒檢測(cè)排毒情況［8］。

（3）環(huán)境執(zhí)法監(jiān)測(cè)存在部門沖突。在縣級(jí)基層，政府并未建立專門的環(huán)境執(zhí)法監(jiān)測(cè)部門，主要以地方農(nóng)業(yè)部門、環(huán)保部門等多個(gè)部門為主體實(shí)施。在此之下，環(huán)境執(zhí)法檢測(cè)浪費(fèi)了過多行政資源，并且容易造成職能沖突，部門之間存在責(zé)任推卸，對(duì)環(huán)境執(zhí)法造成負(fù)面影響。

臨床癥狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：主要依據(jù)水貂臨床癥狀等制定評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)分高說明臨床癥狀明顯(表2)。

表1 水貂犬瘟熱攻毒方法試驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.1 The method of CDV infect the mink

表2 水貂感染犬瘟熱臨床評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.2 The standard score of the mink infected CDV

1.7 水貂的血項(xiàng)檢測(cè)

攻毒后從第0天隔日采血，并用抗凝管采集各組水貂血液，用HEMAVET 950FS型血液五分類分析儀對(duì)每只貂血液進(jìn)行血相分析。

1.8 水貂各臟器病理組織切片制備

將即將死亡的水貂麻醉后，取肺、脾、腸等臟器于組織固定液中，選擇適宜時(shí)間制備石蠟切片。把各臟器修成厚度小于2mm的小組織塊，放入組織處理標(biāo)準(zhǔn)盒，流水沖洗24h后，利用生物組織自動(dòng)脫水機(jī)進(jìn)行脫水、透明和浸蠟；石蠟包埋機(jī)包埋成標(biāo)準(zhǔn)蠟塊，每個(gè)蠟塊切4μL厚的連續(xù)切片4片，進(jìn)行編號(hào)，烘干后4℃保存.

2 結(jié)果

2.1 攻毒后水貂排毒情況

犬瘟熱各毒病感染水貂后排毒時(shí)間并不相同，從收集各部分樣本檢測(cè)結(jié)果可初步判定各毒株在水貂各器官排毒情況也不相同，第4天開始，攻ZACDV的水貂，可以在其肛拭子、鼻洗液里檢測(cè)到犬瘟熱病毒，而Monkey-CDV毒株在肛拭子、鼻洗液里從第6天開始排毒，HC-CDV從第6天的肛拭子、鼻洗液開始檢測(cè)到犬瘟熱病毒。

表3 第4天犬瘟熱病毒攻擊水貂結(jié)果Tab.3 The result of the mink infected CDV at the 4th day

2.2 感染犬瘟熱病毒各組水貂臨床評(píng)分結(jié)果

攻毒后第20天計(jì)算水貂臨床總體評(píng)分情況。感染藏獒源犬瘟熱病毒的水貂臨床癥狀特別明顯；感染猴源犬瘟熱病毒的水貂臨床癥狀較為明顯；感染犬源犬瘟熱病毒的水貂沒有表現(xiàn)出臨床癥狀(表4).

表4 犬瘟熱病毒攻擊水貂20天后總體評(píng)分結(jié)果Tab.4 The overall score of the mink effected CDV after 20days

2.3 水貂感染犬瘟熱病毒后血項(xiàng)變化

水貂感染犬瘟熱后單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和白細(xì)胞在感染后10～12d均明顯下降(圖1、2、3)。

2.4 水貂感染犬瘟熱后體溫變化

水貂感染犬瘟熱病毒后體溫不同程度呈現(xiàn)雙相熱變化(圖4、5、6)。

2.5 感染犬瘟熱病毒組織病理變化

感染犬瘟熱病毒水貂肺臟表現(xiàn)為間質(zhì)性肺炎，肺泡間隔增厚，腸壁內(nèi)毛細(xì)血管擴(kuò)張，肺泡有滲出物，肺細(xì)胞大量增生(彩插3圖7)；小腸絨毛短縮，上皮細(xì)胞脫落，黏膜固層毛血管擴(kuò)張、充血(彩插3圖8)。

水貂犬瘟熱目前已成為影響我國(guó)水貂養(yǎng)殖業(yè)的重要傳染性疾病，開始時(shí)在貂場(chǎng)小范圍傳播，繼而在整個(gè)水貂場(chǎng)流行，病死率高。建立水貂犬瘟熱動(dòng)物模型不僅有助于水貂犬瘟熱病毒的研究，而且能夠?yàn)檠兄扑跞翢嵋呙缣峁┠Ｐ停?0］。許多科研人員進(jìn)行了雪貂犬瘟熱動(dòng)物模型的建立，但是對(duì)于水貂犬瘟熱動(dòng)物模型的研究還較少。

圖1 感染犬瘟熱后水貂單核細(xì)胞變化Fig.1 The infected CDV mink monocytes change

圖2 感染犬瘟熱后水貂淋巴細(xì)胞變化Fig.2 The infected CDV mink lymphocytes change

圖3 感染犬瘟熱后水貂白細(xì)胞變化Fig.3 The infected CDV mink WBC change

3 討論

圖4 水貂感染藏獒源犬瘟熱后體溫變化1-4號(hào)為攻毒水貂，5號(hào)為對(duì)照Fig.4 The body temperature changes of the m ink infected Tibetan mastiff CDV

圖5 水貂感染猴源犬瘟熱后體溫變化1-4號(hào)為攻毒水貂，5號(hào)為對(duì)照Fig.5 The body temperature changes of the mink infected monkey CDV

圖6 水貂感染犬源犬瘟熱后體溫變化1-4號(hào)為攻毒水貂，5號(hào)為對(duì)照Fig.6 The body temperature changes of the m ink infected canine CDV

本試驗(yàn)中應(yīng)用穩(wěn)定的藏獒源犬瘟熱病毒、猴源犬瘟熱病毒和犬源犬瘟熱病毒對(duì)水貂進(jìn)行了攻毒試驗(yàn)，確定了建立水貂犬瘟熱動(dòng)物模型的犬瘟熱毒株。藏獒源犬瘟熱對(duì)水貂有較強(qiáng)的致病性，水貂臨床癥狀明顯通常表現(xiàn)為眼、鼻有粘稠分泌物，有的水貂眼被分泌物封閉，糞便呈黃綠色粘稠狀，體溫呈現(xiàn)雙相熱，有的水貂發(fā)生神經(jīng)癥狀，食欲減退，病程為2-4周，最終因機(jī)體器官功能衰竭死亡。當(dāng)水貂感染犬瘟熱病毒后的2周左右白細(xì)胞下降明顯，淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞也有不同程度的降低。病理組織切片表明，當(dāng)水貂感染犬瘟熱病毒后期，肺內(nèi)充滿炎性細(xì)胞和粘性分泌物，對(duì)小腸粘膜也有很大的損傷，常出現(xiàn)腸粘膜脫落，腸絨毛壞死等，這為臨床診斷水貂犬瘟熱病毒提供參考。

在水貂犬瘟熱動(dòng)物模型建立過程中，試驗(yàn)重復(fù)了2次，均得到相同結(jié)果，建立的水貂犬瘟熱模型較為穩(wěn)定，這為水貂犬瘟熱疫苗研制，藥物開發(fā)均有較好研究基礎(chǔ)，同時(shí)建立的水貂犬瘟熱模型具有較好的應(yīng)用前景。

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The M ink M odel Establishm ent of Canine Distem per Virus

WANG Sheng-le1，2，3，WANG Tie-cheng2，3，F(xiàn)ENG Na1，2，3，LI Yuan-guo2，YU Zhi-jun2，DING Jie2，XU Wei-wei2，XIN Yue2，YUE Xiu-fang2，WANG Zheng2，ZHENG Xue-xing2，3，YANG Song-tao2，3，HUANG Geng2，3，GAO Yu-wei2，3，XIA Xian-zhu2，3
(1.Jilin Agricultural university Institute of Animal Science；Changchun 130062，China；
2.Military Veterinary institute，Academy of Military Medical Science of PLA，Changchun 130062，China；3.Institute of Military Veterinary，AMMS，Key laboratory of Jilin province for zoonosis
prevention and control，Changchun 130062，China)

Ob jective To establish a mink model of canine distemper virus，and different canine distemper virulent strain virulence was evaluated by the mink animal model for laying the foundation for the study of the canine distemper virus.M ethods Different canine distemper viruses were separated from specimens，cell-cultured，passaged and determined virulence of CDV.And we compared the virulence of different generation virulent strains，stable virulent strains were used for establishing mink canine distemper animal model and evaluated their virulence.Resu lts We screened 3canine distemper virulent strains and made dog animal experiments，the three viruses infected dogs and they showed a strong clinical symptoms，and mink animal model was established using different generations.Conclusion we successfully established the canine distemper animal model and evaluated virulence of CDV.

Mink；Model，animal；Virulence evaluation；Canine distemper virus

973農(nóng)業(yè)生物安全項(xiàng)目(20120001)。

王勝樂，男，碩士；研究領(lǐng)域：主要從事動(dòng)物病毒學(xué)研究。E-mail：wangshengle19850919@gmail.com。

夏咸柱，E-mail：xia_xzh@yahoo.com.cn；高玉偉，E-mail：gywtext@yahoo.com.cn。

R332

A

1671-7856(2012)11-0054-05

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.0011.0012

2012-10-19