彭清妹，周志軍，胡曉玲，黃筱金

(1井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江西吉安343000;2南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

流行病學(xué)調(diào)查表明，我國育齡期夫婦不孕癥的患病率已達(dá)10%～15%，并逐年上升。生殖醫(yī)學(xué)是一門近20余年才發(fā)展起來的新興邊緣學(xué)科，它以輔助生殖技術(shù)(ART)為重點，應(yīng)用最廣泛的技術(shù)是體外受精—胚胎移植(IVF-ET)，俗稱“試管嬰兒”。20多年來，在許多方面，如促排卵、卵子的采集、受精和胚胎培養(yǎng)等影響胚胎質(zhì)量方面取得很大的進(jìn)展，胚胎移植回子宮的成功率可達(dá)90%，但是即使形態(tài)良好的胚胎移植入子宮腔，IVF-ET的妊娠率仍然很低，為30%～40%;目前胚胎的植入率仍只有10%～15%［1，2］?？梢娭踩胧∫殉蔀橛绊慖VF-ET成功的主要因素。國外研究表明植入過程中一些占主要地位的細(xì)胞因子或基因表達(dá)低下，影響胚胎和子宮內(nèi)膜的同步發(fā)育，從而導(dǎo)致IVF-ET的失敗。本研究通過探討血清內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)在胚胎早期種植中的預(yù)測價值，及卵泡液內(nèi)VEGF水平與IVF-ET結(jié)局的相關(guān)性，為今后進(jìn)一步的臨床和科研工作做準(zhǔn)備。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2010年3～12月在生殖中心接受IVF-ET的不孕癥患者50例，年齡23～36歲;其中原發(fā)不孕25例，繼發(fā)不孕25例;不孕年限3～9年。納入標(biāo)準(zhǔn):①年齡≤38歲;②具有正常的月經(jīng)周期，周期27～32 d;③3個月內(nèi)無激素使用史及宮腔操作史;④基礎(chǔ)內(nèi)分泌正常;⑤周期中至少有1個Ⅰ級或Ⅱ級胚胎可供移植;⑥排除多囊卵巢綜合征、子宮內(nèi)膜異位癥、腫瘤等。胚胎分級:根據(jù)無核碎片占整個胚胎的比例將胚胎質(zhì)量分為4級［3］:①Ⅰ級:細(xì)胞大小均勻，形狀規(guī)則，透明帶完整;胞質(zhì)均勻清晰，沒有顆粒現(xiàn)象，碎片0～5%;Ⅱ級:細(xì)胞大小略不均勻，形狀略不規(guī)則，胞質(zhì)可有顆?，F(xiàn)象，碎片5%～20%;③Ⅲ級:細(xì)胞大小明顯不均勻，可有明顯的形狀不規(guī)則，胞質(zhì)可有顆?，F(xiàn)象，碎片21% ～50%;④Ⅳ級:細(xì)胞大小嚴(yán)重不均勻，胞質(zhì)可有嚴(yán)重顆?，F(xiàn)象，碎片在50%以上。

1.2 分組標(biāo)準(zhǔn) 按妊娠結(jié)局將50例不孕患者分為2組，A組:妊娠組，30例，年齡(30.67±2.73)歲，不孕年限(5.00±1.26)年，基礎(chǔ)卵泡數(shù)(12.4± 2.7)個;B組:非妊娠組，20例，年齡(32.25±3.86)歲，不孕年限(5.25±2.63)年，基礎(chǔ)卵泡數(shù)(12.23 ±2.7)個，兩組一般資料比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。

1.3 診斷標(biāo)準(zhǔn) 胚胎移植后4周行超聲檢查見妊娠囊及胎芽、原始心管搏動或刮宮見絨毛者，診斷為臨床妊娠。

1.4 標(biāo)本采集 于IVF-ET周期中的取卵日、移植日及移植后3、7、14 d分別采靜脈血3 mL，并在取卵日采集卵泡液，標(biāo)本采集后均立即經(jīng)離心后分裝－20℃保存待檢測。檢測方法為酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，主要實驗試劑:VEGF定量酶聯(lián)檢測試劑盒。

1.5 監(jiān)測指標(biāo) 基礎(chǔ)血清性激素、基礎(chǔ)卵泡數(shù)、HCG注射日內(nèi)膜，統(tǒng)計促性腺激素(Gn)用量和使用天數(shù)，獲卵數(shù)、受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率，基礎(chǔ)血清性激素采用化學(xué)發(fā)光法測定。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS10.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，率的比較用χ2檢驗，以P≤0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 兩組Gn用量、天數(shù)及HCG日內(nèi)膜厚度比較在IVF-ET治療周期中使用Gn的量及天數(shù)可影響到卵細(xì)胞的質(zhì)量，從而影響到受精、卵裂、胚胎的種植，HCG日內(nèi)膜的厚度也會影響胚胎的種植，最終影響IVF-ET的結(jié)局，而通過對兩組患者的使用Gn的用量、天數(shù)及HCG日內(nèi)膜的厚度比較，兩組無統(tǒng)計學(xué)差異(P均＞0.05)。

2.2 獲卵數(shù)、受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率比較 兩組患者的獲卵數(shù)及卵裂率無明顯差異，而受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率妊娠組高于非妊娠組(P均＜0.05)。見表1。

表1 兩組患者獲卵數(shù)、受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率的比較

2.4 取卵日血清及卵泡液內(nèi)VEGF水平比較 兩組取卵日卵泡液內(nèi)VEGF水平均明顯高于血清，前者是后者的10.05～13.32倍，妊娠組卵泡液內(nèi)VEGF水平高于非妊娠組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，而兩組取卵日血清內(nèi)VEGF水平無明顯差異。見表2。

表2 兩組取卵日血清及卵泡液內(nèi)VEGF水平比較(±s)

表2 兩組取卵日血清及卵泡液內(nèi)VEGF水平比較(±s)

組別 n VEGF(pg/mL)取卵日血清 取卵日卵泡液A組30 41.02±10.28 546.25±74.94 B組 20 46.31±22.91 465.63±56.85 P ＞0.05 ＜0.01

2.3 血清VEGF水平在不同時間的表達(dá)水平比較兩組血清VEGF在取卵日、移植日均有不同程度的下降，妊娠組在移植3 d后呈逐漸上升趨勢，而非妊娠組移植3 d后則呈明顯下降趨勢;妊娠組移植后7及14 d血清VEGF水平高于非妊娠組(P＜0.05)。見表3。

表3 兩組血清VEGF水平在不同時間的表達(dá)水平比較(pg/mL，±s)

表3 兩組血清VEGF水平在不同時間的表達(dá)水平比較(pg/mL，±s)

組別 n 取卵日 移植日 移植后3 d 移植后7 d 移植后14 d A組 30 41.02±10.28 31.03±12.90 49.96±22.09 64.22±25.15 64.65±23.01 B組 20 46.31±22.91 29.22±10.69 53.51±22.74 37.23±14.60 43.11±24.18 P ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05

3 討論

胚胎著床是指胚泡進(jìn)入子宮腔與子宮內(nèi)膜黏附并逐漸埋入子宮內(nèi)膜的過程。調(diào)控胚胎著床的機(jī)制非常復(fù)雜，需要母體與胚胎的協(xié)同，并且著床的過程有多種物質(zhì)的參與。目前現(xiàn)有用來預(yù)測胚胎種植成功的細(xì)胞因子和分子有數(shù)十種，比如細(xì)胞因子、生長因子、細(xì)胞黏附分子、整合素家族、免疫球蛋白超家族和鈣黏附素家族、胞飲突、白血病抑制因子、同源盒基因、雌孕激素受體等［4］。

3.1 VEGF VEGF是Ferrara和Gospdarowiz等于1989年從牛腦垂體濾泡星狀細(xì)胞的體外培養(yǎng)基中純化出來的一種具有兩個亞單位的同源二聚體糖蛋白，屬于血小板衍生生長因子類，目前將同VEGF具有相似功能的因子統(tǒng)稱為VEGF家族，其成員包括: VEGF-A、B、C、D、E、F及胎盤生長因子。VEGF是一組功能強(qiáng)大且能產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，它能夠特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及體內(nèi)新生血管形成并增加血管通特透性。VEGF是一種高效的多功能肽，主要與血管上皮表面的特異性受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。主要功能有［5，6］:促進(jìn)有絲分裂和趨化作用，在體外促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長，在體內(nèi)誘導(dǎo)血管的發(fā)生;增加細(xì)胞質(zhì)的鈣離子濃度;提高微血管的通透性;與酪氨酸激酶受體結(jié)合，激活細(xì)胞介導(dǎo)氧化系統(tǒng)，介導(dǎo)一氧化氮釋放;改變細(xì)胞外基質(zhì)，以利于血管的生長。由于人類女性生殖系統(tǒng)存在獨特的周期性新血管形成，近年來在女性生殖內(nèi)分泌領(lǐng)域中VEGF受到相當(dāng)?shù)闹匾?。它可誘導(dǎo)血管及淋巴管生成，在女性生殖方面貫穿從受精、著床、胎盤形成、胎兒生長、發(fā)育及分娩全過程［7］，而且與子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、乳腺癌、卵巢癌等腫瘤的生成、浸潤、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，還可用于臨床對異位妊娠的早期診斷，并在子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。

3.2 VEGF在生殖過程中的作用

3.2.1 VEGF與胚胎發(fā)育及著床 VEGF不僅存在于卵泡液中，還與早期胚胎的發(fā)育及著床密切相關(guān)。Krussel等［8］通過測定植入前胚胎VEGF mRNA的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，受孕者植入前胚胎的培養(yǎng)基VEGF mRNA的表達(dá)呈陽性，而未受孕者培養(yǎng)基中未測及，VEGF mRNA在89%的胚胎上有表達(dá)，這證實VEGF在人類種植前胚胎的表達(dá)對著床過程中血管的形成發(fā)揮了作用。VEGF除了促進(jìn)內(nèi)膜的增生和分化，還調(diào)節(jié)早期無血管胚胎的發(fā)育，促進(jìn)胚胎的著床。劉以訓(xùn)研究發(fā)現(xiàn)VEGF在胚胎植入早期，在螺旋動脈內(nèi)皮細(xì)胞、絨毛層細(xì)胞、母胎界面基底部位都有特異性的表達(dá)，表明VEGF參與了絨毛內(nèi)胎兒血管的新生和母胎蛻膜組織內(nèi)血管通透性的調(diào)節(jié)［9］。VEGF還可以促進(jìn)一氧化氮和前列環(huán)素的生成，而前列環(huán)素是胚胎著床和子宮內(nèi)膜蛻膜化的主要啟動因子［10］，在著床期前后促進(jìn)血管的發(fā)生，使子宮內(nèi)膜血管通透性增加，對胚胎的成功著床至關(guān)重要。Lee等［11］發(fā)現(xiàn)在胚胎移植后11～14 d妊娠者的血VEGF水平高于非妊娠者，胚胎移植后15～17 d妊娠者血VEGF迅速下降，提示VEGF主要對胚胎著床的早期階段產(chǎn)生影響。當(dāng)VEGF不足時，不利于胚胎的早期發(fā)育與著床，其機(jī)理可能與子宮內(nèi)膜的容受性下降、黃體功能低下、早期絨毛血管形成不良等有關(guān)，即使著床也較易發(fā)生早期流產(chǎn)。而且VEGF直接影響胚胎的質(zhì)量，Van Blerkon等［12］研究發(fā)現(xiàn)來源于低含氧量卵泡的卵子，不但受精率低，胚胎移植后妊娠率也較低。

3.2.2 VEGF對受精率及妊娠率的影響 在實驗室條件穩(wěn)定和精子質(zhì)量正常的情況下，卵母細(xì)胞的質(zhì)量則成為影響受精率的主要因素。卵丘的狀態(tài)、透明帶的形態(tài)及厚度和卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞連接的緊密程度均可以影響精子穿透卵母細(xì)胞，從而影響著受精率。聞姬等［13］研究發(fā)現(xiàn)卵泡液的VEGF水平在一定范圍內(nèi)(510～759 ng/L)受精率、卵裂率及妊娠率最高;Barritt等［14］推測當(dāng)卵泡液內(nèi)VEGF水平較低時，新生血管生成減少，血管通透性下降，使卵細(xì)胞內(nèi)線粒體DNA缺失增加，功能完善的線粒體減少，卵細(xì)胞內(nèi)ATP的含量下降，從而影響著卵細(xì)胞的質(zhì)量，受精的能力則隨之下降;Filicori等［15］認(rèn)為卵泡液VEGF水平較低時，血漿蛋白外滲減少，使卵泡液減少，從而不能為卵細(xì)胞的生長發(fā)育提供Gn、類固醇激素及各種生長因子，由于卵細(xì)胞從血液循環(huán)中獲得的外源性激素下降導(dǎo)致透明帶增厚，從而影響精子的穿透，影響受精率。而卵泡液內(nèi)VEGF水平過高時，同樣影響受精率及妊娠率，可能與卵細(xì)胞內(nèi)低糖、缺氧使卵細(xì)胞發(fā)育不良和退化有關(guān)。因此卵泡液內(nèi)VEGF過高或過低均會影響卵細(xì)胞的受精率，最終影響妊娠率。

3.3 妊娠組與非妊娠組中VEGF的表達(dá) Pellicer等［16］、Chad等［17］證實隨著年齡的增長卵泡微循環(huán)減少，局部缺氧，使VEGF水平隨著年齡的增長而增加，故在本研究中，納入研究的患者年齡均≤38歲;具有正常的月經(jīng)周期，周期在27～32 d;3個月內(nèi)無激素使用史及宮腔操作史;基礎(chǔ)內(nèi)分泌正常;IVFET或ICSI-ET周期中至少有1個Ⅰ級或Ⅱ級胚胎可供移植;而且排除了多囊卵巢綜合癥、子宮內(nèi)膜異位癥等疾病。兩組患者的年齡、不孕年限、基礎(chǔ)卵泡數(shù)及基礎(chǔ)性激素經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析均無統(tǒng)計學(xué)意義，而在IVF-ET周期中Gn的使用天數(shù)及使用總量將影響到卵子的質(zhì)量，從而影響卵子的受精、卵裂，最終影響妊娠結(jié)局，而Gn日內(nèi)膜的厚度會直接影響胚胎的種植，而經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，兩組上述因素均無統(tǒng)計學(xué)差異。因此在排除外在影響因素的條件下，通過檢測IVF-ET后不同時期血清中VEGF水平的變化來預(yù)測胚胎的早期種植，而通過檢測取卵日卵泡液中VEGF的水平來推測其與妊娠結(jié)局的關(guān)系。

IVF-ET周期后根據(jù)妊娠結(jié)局將兩組分為妊娠組和非妊娠組，兩組患者的獲卵數(shù)及卵裂率經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析，無顯著性差異，取卵日兩組患者血清VEGF水平無明顯差異，而妊娠組取卵日卵泡液內(nèi)VEGF的水平明顯高于非妊娠組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且妊娠組受精率與優(yōu)胚率高于非妊娠組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。故卵泡液內(nèi)VEGF水平影響卵子的成熟度、卵子質(zhì)量、卵泡液內(nèi)VEGF水平高、卵子成熟度高、卵子質(zhì)量好、受精率及優(yōu)質(zhì)胚胎率高、卵泡液內(nèi)VEGF水平低、卵子成熟率低、卵子質(zhì)量差、受精率與優(yōu)質(zhì)胚胎率低，這與Van Blerkon等［12］及王克華等［18］的研究結(jié)果是一致的，并與聞姬等發(fā)現(xiàn)卵泡液內(nèi)VEGF水平過高過低均會影響卵母細(xì)胞質(zhì)量、受精率及優(yōu)質(zhì)胚胎率，且卵泡液內(nèi)VEGF水平本在510～760 ng/L妊娠結(jié)局最好的結(jié)果是相一致的。研究通過動態(tài)監(jiān)測IVF-ET后兩組患者不同時間血清內(nèi)VEGF水平表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)兩組取卵日至移植日血清VEGF水平有不同程度的下降，移植日至移植后3 d則均有不同程度的上升，但兩組之間無明顯差異，妊娠組移植3 d后血清VEGF水平逐漸上升，而非妊娠組于移植3 d后有明顯的下降，兩組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，Lee等［11］發(fā)現(xiàn)IVF-ET后11～14 d，妊娠婦女血清中VEGF高于非妊娠者，而在ET后15～17 d血清VEGF水平急劇下降，提示VEGF對胚胎著床的早期產(chǎn)生影響，而本研究發(fā)現(xiàn)在ET后7 d兩組血清VEGF水平即出現(xiàn)明顯的差異，故在移植后動態(tài)監(jiān)測血清VEGF水平的變化能更早地預(yù)測胚胎的種植，從而更早地預(yù)測IVF-ET的妊娠結(jié)局。Lee等［19］證實HCG能促進(jìn)黃體顆粒細(xì)胞產(chǎn)生VEGF，故在IVF-ET周期中如果給予部分患者HCG支持，能使黃體顆粒細(xì)胞產(chǎn)生VEGF增加，使卵泡液內(nèi)VEGF水平提高，促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟，提高卵子的質(zhì)量、受精率、優(yōu)胚率，并且血清內(nèi)VEGF水平也相應(yīng)增加，有利于胚胎的種植，從而改善IVF-ET周期的妊娠結(jié)局，提高IVF-ET周期的妊娠率。

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