李 華，張振銘，朱志圖

(1遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州121000;2遼河油田第二職工醫(yī)院)

胃癌術后對射線治療不敏感，化療成為綜合治療的主要措施，但胃癌多藥耐藥(MDR)的存在常導致化療有效率降低，使其5年生存率＜20%。如能對胃癌的MDR進行干預甚至逆轉，對提高化療療效、延長患者生存期有重大意義。小白菊內酯(PN)是從傳統(tǒng)藥用植物小白菊中提取的有效成分。研究證實［1～3］，其在體外實驗中對多種腫瘤細胞具有抑制增殖和誘導凋亡的作用，還發(fā)現其能增強某些腫瘤細胞株對藥物的敏感性［4］，但在此領域的研究尚不深入。2011年12月～2012年8月，我們以胃癌耐藥細胞株為研究對象，探討NP對其增殖及藥物敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 PN(美國Sigma公司)，順鉑(DDP，山東德州制藥廠)，RPMI 1640(美國 Sigma公司)，SGC-7901/DDP胃癌耐藥細胞株(南京凱基生物技術有限公司)，MTT(Solarbio公司，NF-κB p65轉錄因子檢測試劑盒(美國Chemicon公司)，NF-κB p65的引物(上游引物5'-GGGAAGGAACGCTGTCAGAG-3'，下游引物5'-TAGCCTCAGGGTACTCCATCA-3'，目的片段369 bp)和內參照β-actin的引物(上游引物5'-GCATGGAGTCCTGTGGCAT-3'，下游引物5'-CTAGAAGCATTTGCGGTGG-3'，目的片段239 bp)、第一鏈cDNA合成試劑盒、PCR擴增試劑盒購自上海生工生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將胃癌耐藥細胞 SGC-7901/ ADM接種于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在含5%CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)至對數生長期。

1.2.2 PN對細胞增殖的影響觀察 取對數生長期的細胞，制成單細胞懸液，調整細胞濃度為5×104/ mL，接種于96孔板中，每孔200 μL。培養(yǎng)至對數生長期后，用含不同濃度PN(0、5、10、20、40 μmol/L)的培養(yǎng)基處理細胞，其中0 μmol/L PN為對照組。分別培養(yǎng)24、48、72 h后收集細胞，采用MTT法檢測PN對細胞的生長抑制作用，按試劑盒說明操作。細胞增殖抑制率=(1－處理組吸光度值/對照組吸光度值)×100%。

1.2.3 PN與DDP協同性觀察 從1.2.1中得知，20 μmol/L的PN作用胃癌細胞24 h時，可明顯抑制細胞增殖。再以20 μmol/L PN、5 μg/L DDP、10 μg/ L DDP、20 μmol/L PN+5 μg/L DDP、20 μmol/L PN +10 μg/L DDP作用于對數生長期的胃癌細胞24 h，以培養(yǎng)基為對照組，以MTT法測算細胞增殖抑制率。根據公式進行協同性判定，q=E(AB)/(EA+EBEA×EB)。EAB為聯合處理的抑制率，EA、EB單用A、B藥處理的抑制率，q＜0.85兩藥拮抗，在0.85～1.15為作用單純相加，＞1.15有協同作用。

1.2.4 細胞中NF-κB p65 mRNA的檢測 采用RT-PCR法。將細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)至對數生長期，分別以培養(yǎng)基、10 μg/L DDP、20 μmol/L PN、20 μmol/L PN+10 μg/L DDP處理24 h，提取各組細胞總RNA;各取1 μg總RNA，一步法擴增成cDNA;取2 μL cDNA以NF-κB p65的上下游引物和內參照β-actin的上下游引物進行PCR擴增，反應體系25 μL。循環(huán)參數:94℃ 5 min，94℃30 s。58℃ 1 min，72℃ 45 s，共25個循環(huán);再72℃10 min。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外分析儀觀察、照相，并用HPlSA 1000圖文分析系統(tǒng)進行半定量分析，用NF-κB與β-actin條帶的灰度比值表示NF-κB的相對表達水平。

1.2.5 細胞中NF-κB p65蛋白的檢測 用Western blot法。接種與處理同1.2.4，收集細胞提取總蛋白，每孔上樣60 μg蛋白;總蛋白經聚丙烯酰胺凝膠電泳(每孔60 μg蛋白)后轉至硝酸纖維素膜后，于室溫條件下封閉1.5 h;再分別用一抗雜交，4℃過夜，洗膜3次，每次10 min;再與稀釋過的辣根過氧化物酶標記的二抗孵育1 h，洗膜3次，每次10 min。采用HPlsA 1000圖文分析系統(tǒng)分析膠片，進行半定量分析(計算各條帶的積分光密度值，以NF-κB p65蛋白條帶的積分光密度值與對應內參照β-actin的積分光密度值之比作為目的蛋白的相對表達量)。

1.2.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0軟件。所得數據用±s表示，用t檢驗。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PN對胃癌細胞增殖的影響 隨著作用時間的延長和藥物濃度的增加，PN對胃癌細胞的抑制作用逐漸增強(P均＜0.05)，其中以20 μmol/L PN作用24 h時的抑制效應較明顯。見表1。

表1 不同濃度PN對胃癌細胞增殖抑制率的影響(%，±s)

表1 不同濃度PN對胃癌細胞增殖抑制率的影響(%，±s)

24 h 48 h 72 h 5μ PN 細胞增殖抑制率mol/L 4.20±0.73 10.02±0.05 18.35±0.41 10 μmol/L 11.63±0.21 18.73±0.34 30.53±0.74 20 μmol/L 32.50±0.27 58.29±0.53 78.21±0.54 40 μmol/L 74.00±0.38 91.53±0.29 97.05±0.61

2.2 PN與DDP的協同性觀察結果 20 μmol/LPN處理24 h后胃癌細胞增殖抑制率為32.50% ± 0.27%，5、10 μg/L DDP處理后分別為20.93% ± 0.15%、40.27%±1.04%20 μmol/L PN聯合5、10 μg/L DDP處理后分別為 53.03% ±0.67%、77.96%±0.26%。根據公式判定 PN聯合5、10 μg/L DDP的協同性，q分別為1.19、1.17，均 ＞1.15，表示而二者具有協同性。

2.3 胃癌細胞中NF-κB p65 mRNA及其蛋白檢測結果 培養(yǎng)基、10 μg/L DDP、20 μmol/L PN、20 μmol/L PN+10 μg/L DDP處理24 h，胃癌細胞中NF-κB p65 mRNA分別為0.437±0.270、0.406± 0.253、0.371±0.394、0.301±0.316，NF-κB p65蛋白分別為0.695±0.115、0.672±0.067、0.452± 0.290、0.361±0.104，20 μmol/L PN+10 μg/L DDP與其他三者比較，P均＜0.05。

3 討論

MDR的存在是困擾腫瘤治療的一個難題，也是影響腫瘤治療療效、甚至導致化療失敗的重要因素。目前使用的腫瘤MDR逆轉化劑在體內達到有效濃度時所需的劑量過大，不良反應明顯，因而限制了它們的臨床應用。

目前，腫瘤MDR的研究約有30余年的歷史，其中明確的途徑如下:①MDR-1/P-gp的過度表達;②多藥耐藥相關蛋白(MRP)的過度表達;③肺耐藥相關蛋白(LRP)對藥物的胞吐作用;④細胞解毒系統(tǒng)和DNA損傷修復作用增強;⑤藥物靶點在質和量上的改變，減弱藥物的細胞毒性作用;⑥凋亡抑制基因(如Survivin、Bcl-2)表達提高及促凋亡基因(如Bax、Fas)表達的降低;⑦細胞外環(huán)境(pH、溫度、氧濃度)的改變等;⑧其他與MDR相關的因子，如COX-2抑制劑物也產生交叉耐藥。目前研究認為，腫瘤細胞的這種MDR是由多種因素綜合作用造成的。

PN是從傳統(tǒng)中藥中提取的有效生物活性成分，不僅具有抗炎、抑菌、解痙作用，而且不良反應小。目前已經證實，PN在體內外實驗中對多種腫瘤增殖具有抑制作用，如乳腺癌、白血病、胃癌、肝癌、胰腺癌、大腸癌、肺癌、前列腺癌、骨肉瘤等;進一步研究發(fā)現，PN的抗腫瘤作用主要是通過抑制轉錄因子NF-κB的活性和誘導凋亡實現的。NF-κB的激活參與了細胞生長調控、腫瘤的形成及MDR的形成，使其成為腫瘤治療的潛在新靶點［5，6］。研究還發(fā)現，PN能增強某些腫瘤細胞株對藥物的敏感性，如Riggins等［7］研究發(fā)現PN能增強乳腺癌抗雌激素耐藥細胞株MCF-7對他莫昔芬、氟維司群的敏感性，其抗他莫昔芬機制與NF-κB調控AKT通路有關。Kim等研究發(fā)現，PN能通過抑制NF-κB的DNA聚集增強維甲酸對白血病HL-60細胞療效。本實驗中，PN能明顯抑制胃癌耐藥細胞株的增殖，抑制作用呈時間和濃度依賴性;PN與DDP聯合組與單藥組相比抑制作用更顯著，經檢驗兩者具有協同作用。通過RT-PCR檢測證實PN可明顯下調胃癌細胞的NF-κB p65 mRNA的轉錄水平，進一步通過Western blot檢測發(fā)現PN+ DDP聯合用藥者組的NF-κB p65蛋白表達強度明顯減少，明顯少于PN、DDP單藥組。本實驗結果證實了小白菊內酯是NF-κB的抑制劑，能抑制胃癌細胞中NF-κB的表達;并且PN與DDP有協同抗腫瘤作用，PN能增強胃癌細胞株對DDP的敏感性，從而明顯抑制腫瘤細胞的增殖，該作用可能與NP降低NF-κB的轉錄和蛋白表達有關。然而，小白菊內酯增強胃癌耐藥細胞株對藥物敏感性的分子機制還有待于進一步深入的研究。

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