張孟瑜，賀 凱，李 波，夏先明

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川瀘州646000)

高脂血癥是由于脂質(zhì)代謝或運轉(zhuǎn)異常使血漿中一種或多種脂質(zhì)高于正常范圍的病癥，分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩類。近年來，由于人們生活習(xí)慣特別是飲食習(xí)慣改變等多種因素的影響，高脂血癥的發(fā)病率有明顯增高的趨勢，是當前的常見病、多發(fā)病。膽固醇代謝紊亂是其中的重要組成部分。而目前降脂治療的方法有限。我們于2009年4月～2010年8月進行本研究，擬以法尼基衍生物X受體(FXR)及FXR的靶基因——肝臟中小膽管側(cè)肝細胞毛細膽管膜上分布的膽鹽輸出泵(Bsep)為研究對象，研究在高脂血癥大鼠肝細胞中FXR、Bsep基因表達的狀況，嘗試為高脂血癥治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Wistar大鼠來自瀘州醫(yī)學(xué)院動物中心，雄性、體質(zhì)量(145±8.5)g，60只，隨機分為2組，每組30只，高脂飲食實驗組(簡稱實驗組)、普通飲食對照組(簡稱對照組)。入選前大鼠無高脂血癥和其他疾病存在。

1.2 儀器和試劑 主要儀器有石蠟切片機，自動組織包埋機，光學(xué)顯微鏡照相系統(tǒng)，Image-Pro-Plus圖像分析系統(tǒng)等;主要試劑有免疫組化試劑盒，F(xiàn)XR單克隆抗體及Bsep單克隆抗體等(CHEMICON，美國)。

1.3 實驗方法 高脂飲食的原料包括:膽固醇、去氧膽酸鈉及基礎(chǔ)飼料等。配制時在基礎(chǔ)飼料中按一定質(zhì)量分數(shù)分別加入膽固醇、豬油、蔗糖、膽酸鈉、丙基硫氧嘧啶，加水混合充分攪拌，做成拳頭大小烘干，冷藏備用。喂食3個月，實驗組建立高脂血癥大鼠模型;對照組喂以基礎(chǔ)飼料，飲用普通自來水。定期測定大鼠體質(zhì)量，并于3個月后取血用自動生化儀檢測與脂類相關(guān)生化指標，待確定高脂血癥大鼠模型建立成功后，取實驗組和對照組肝臟組織，石蠟切片后用免疫組化SP法檢測2組大鼠肝臟組織的FXR及Bsep表達強度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS14.0統(tǒng)計軟件進行分析，測得數(shù)據(jù)用±s表示，組間差異比較采用t檢驗，免疫組化SP法染色結(jié)果采用四格表的Fisher確切概率法檢驗，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組大鼠體質(zhì)量和臟器重量、血清指標變化

2組大鼠喂食3個月均存活，未出現(xiàn)死亡，其體質(zhì)量和臟器重量的變化見表1，血清中脂類變化指標見表2。

表1 2組大鼠體質(zhì)量和肝重量的變化(g，±s)

表1 2組大鼠體質(zhì)量和肝重量的變化(g，±s)

注:與對照組比較，△P＜0.05

組別肝重量對照組 145.36±8.25 168.24±7.34 195.17±9.46 204.69體質(zhì)量實驗前 第1個月 第2個月 第3個月±6.27 18.02±0.75實驗組 145.56±8.36 175.14±10.65△ 194.75±7.48 202.03±5.19 21.06±0.58△

表2 各組大鼠血清指標的變化(mmol/L，±s)

表2 各組大鼠血清指標的變化(mmol/L，±s)

注:與對照組比較，△P＜0.05

組別 血糖 膽固醇 甘油三酯 高密度脂蛋白 低密度脂蛋白對照組 5.11±0.89 1.45±0.21 0.56±0.15 0.76±0.13 0.19±0.10實驗組 5.13±0.87 3.36±0.42△ 2.85±0.13△ 0.47±0.11△ 0.51±0.12△

2.2 免疫組化SP法染色結(jié)果 見插頁Ⅱ圖11。肝臟組織中FXR及Bsep基因出現(xiàn)黃色染色顆粒為陽性細胞(綠色箭頭所指)。每張切片隨機選取5個視野，每個視野內(nèi)觀察100個細胞，陽性細胞≥10%為陽性，否則為陰性。實驗組FXR基因表達陽性率為75%，對照組為17.3%(χ2=9.932，P＜0.05);實驗組Bsep基因表達陽性率為76.7%，對照組為18.5%(χ2=10.773，P＜0.05)。

3 討論

血脂是人體血液中所含各類脂質(zhì)的總稱，主要的脂質(zhì)為膽固醇和中性脂肪(甘油三酯)。通常成年人空腹血清中總膽固醇超過5.72 mmol/L，甘油三酯超過1.70 mmol/L，可診斷為高脂血癥。大量的基礎(chǔ)和臨床研究對高脂血癥原因進行探索，表明其形成與多種因素的參與和作用有關(guān)，而膽固醇的過高分泌和代謝障礙、中性脂肪的蓄積是其重要的形成條件，主要有如下幾點:肝臟從血漿脂蛋白獲得膽固醇增多;肝臟內(nèi)各種膽固醇合成增加;含高膽固醇和高飽和脂肪酸飲食的攝入;肝臟膽固醇胞內(nèi)轉(zhuǎn)運及微管膜膽固醇轉(zhuǎn)運出胞增加;肝臟膽固醇酯水解增加;肝內(nèi)膽固醇酯化減少;肝內(nèi)膽汁酸合成減少;中性脂肪的攝入增加;中性脂肪的代謝減少;基礎(chǔ)血漿低密度脂蛋白—膽固醇(LDL-C)偏高;血漿甘油三酯濃度升高;熱量過多、遺傳因素、內(nèi)分泌代謝性疾病等。這些改變均可引起機體游離膽固醇濃度增加，中性脂肪的含量增加。我國每年因高脂血癥引起的心肌梗死、腦梗死、冠心病、糖尿病、中風等致殘、致死人數(shù)呈逐年上升趨勢。在不斷的調(diào)查總結(jié)和治療中，人們對高脂血癥成因的研究有了很大進展。近年來，人們對其形成的綜合因素更加關(guān)注，對高脂血癥發(fā)生的分子生物學(xué)機制，包括遺傳因素等進行了全面的研究并尋求新的治療方法。而對FXR及其調(diào)控下的Bsep的研究發(fā)現(xiàn)，高脂血癥時其在膽汁酸及膽固醇代謝中發(fā)揮著重要的作用，可為防治高脂血癥提供新的治療方向。

FXR是一種孤兒核受體，具有典型的核受體結(jié)構(gòu)，屬于激素核受體超家族的一員［1～3］。人類ABCB11基因位于第二條染色體長臂上2q24～31，含有28個外顯子，編碼產(chǎn)生一種跨膜ABCB11蛋白，即Bsep。Bsep主要存在于肝臟中，位于肝細胞的毛細膽管面，由1 321個氨基酸組成，屬于ATP結(jié)合盒超家族成員。Bsep的表達和功能發(fā)生變化則直接導(dǎo)致膽汁酸鹽的分泌排泄發(fā)生變化，多種肝臟淤膽性疾病與此相關(guān)［4～6］。而大鼠Bsep能轉(zhuǎn)運與?；墙Y(jié)合的鵝脫氧膽酸和熊脫氧膽酸，不轉(zhuǎn)運甘氨膽酸和游離膽酸，小鼠Bsep則轉(zhuǎn)運甘氨膽酸，體外動物實驗證實，Bsep基因轉(zhuǎn)染后的細胞，相應(yīng)膽汁酸的轉(zhuǎn)運能力均增強。已經(jīng)證實，F(xiàn)XR在轉(zhuǎn)錄水平可誘導(dǎo)Bsep的表達，F(xiàn)XR通過和這些基因啟動子上的FXR反應(yīng)元件結(jié)合從而調(diào)控這些基因的表達［7～9］。膽汁酸的肝腸循環(huán)則明確表現(xiàn)出FXR與Bsep的相互關(guān)系及二者在膽汁酸的分泌及轉(zhuǎn)運中所起到的相應(yīng)作用。

本實驗我們已證實高脂血癥時大鼠的FXR與Bsep基因表達增加，說明膽汁酸的增加會伴隨FXR基因、Bsep基因表達增強，相對應(yīng)來說膽汁酸分泌及轉(zhuǎn)運也在增強。提示我們，F(xiàn)XR及其靶基因BSEP的發(fā)現(xiàn)可能會成為新的治療高脂血癥靶點。Bsep具有特異性，其作用是通過消耗ATP將肝細胞內(nèi)的膽鹽分泌到毛細膽管中，是影響膽汁形成最重要的因素［10］。在目前臨床應(yīng)用的降低血清膽固醇藥物中，常用的有膽汁酸螯合劑、HMG-CoA還原酶抑制劑、苯氧芳酸類等。最常用的他汀類藥物可抑制內(nèi)源性膽固醇合成的限速酶HMG-CoA還原酶活性，繼發(fā)性誘導(dǎo)低密度脂蛋白受體活性，使肝攝取血清LDL-C的能力增加，降低血清LDL-C，被證明是有效的降低LDL-C藥物。然而這些藥物普遍存在服用量大、胃腸道反應(yīng)明顯、患者耐受性差等缺點，阻礙了其作為臨床治療藥物的廣泛應(yīng)用。FXR與Bsep基因代謝調(diào)節(jié)作用的研究將有助于人們更好地認識膽固醇及膽汁酸代謝紊亂機制，為高脂血癥及其相關(guān)疾病找到新的治療方法和手段。

［1］Crawley ML.Farnesoid X receptor modulators:a patent review［J］.Expert Opin Ther Pat，2010，20(8):1047-1057.

［2］Kuipers F，Stroeve JH，Caron S，et al.Bile acids，farnesoid X receptor，atherosclerosis and metabolic control［J］.Curr Opin Lipidol，2007，18(3):289-297.

［3］Martin IV，Schmitt J，Minkenberg A，et al.Bile acid retention and activation of endogenous hepatic farnesoid-X-receptor in the pathogenesis of fatty liver disease in ob/ob-mice［J］.Biol Chem，2010，391(12):1441-1449.

［4］Cariou B.The farnesoid X receptor(FXR)as a new target in nonalcoholic steatohepatitis［J］.Diabetes Metab，2008，34(6 Pt 2): 685-691.

［5］Mencarelli A，F(xiàn)iorucci S.FXR an emerging therapeutic target for the treatment of atherosclerosis［J］.J Cell Mol Med，2010，14(1-2):79-92.

［6］Lam P，Pearson CL，Soroka CJ，et al.Levels of plasma membrane expression in progressive and benign mutations of the bile salt export pump(Bsep/Abcb11)correlate with severity of cholestatic diseases［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2007，293(5):C1709-1716.

［7］Mita S，Suzuki H，Akita H，et al.Inhibition of bile acid transport across Na+/taurocholate cotransporting polypeptide(SLC10A1) and bile salt export pump(ABCB 11)-coexpressing LLC-PK1 cells by cholestasis-inducing drugs［J］.Drug Metab Dispos，2006，34 (9):1575-1581.

［8］Stieger B.Role of the bile salt export pump，BSEP，in acquired forms of cholestasis［J］.Drug Metab Rev，2010，42(3):437-445.

［9］Stieger B.Recent insights into the function and regulation of the bile salt export pump(ABCB11)［J］.Curr Opin Lipidol，2009，20 (3):176-181.

［10］Kis E，Ioja E，Nagy T，et al.Effect of membrane cholesterol on BSEP/Bsep activity:species specificity studies for substrates and inhibitors［J］.Drug Metab Dispos，2009，37(9):1878-1886.