胡曉舟，王少亭，劉乃嘉，張 燕，張 瑾，王 燕，盧永申，楊曉煜，宋春歌，王 琰，楊 宏

(1鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院，鄭州450052;2鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病常見的微血管病變，病理學(xué)特征為腎臟肥大、腎小球基底膜增厚、細(xì)胞外基質(zhì)積聚致系膜區(qū)擴(kuò)張，最后導(dǎo)致腎小球硬化、間質(zhì)纖維化。由于其發(fā)病機(jī)制不明確，尚缺乏理想的治療方法。近年研究發(fā)現(xiàn)，除高血糖和脂質(zhì)代謝異常外，尚有免疫機(jī)制、炎癥因子和血管新生等也參與了DN的發(fā)病［1］。雷帕霉素是一種新型的免疫抑制劑，通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)12 kD的FK506結(jié)合蛋白結(jié)合后特異性阻斷雷帕霉素靶分子(mTOR)，后者參與細(xì)胞代謝、增殖、生長(zhǎng)及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)的調(diào)節(jié)［2］。我們于2011年4～7月進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)，旨在觀察雷帕霉素對(duì)VEGF表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步探討DN的可能發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料 鏈脲佐菌素(STZ，美國(guó)Sigma)，雷帕霉素(美國(guó)LC)，小鼠抗大鼠VEGF抗體、β-actin抗體(美國(guó) Santa Cruz)，二抗試劑(美國(guó)Zymed)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒、TRIzol(法國(guó)Transgene)，Taq DNA聚合酶、10×buffer、dNTP (立陶宛Fermentas)，總RNA提取試劑(加拿大Bio Basic)，ECL發(fā)光試劑盒(北京中山)。引物由北京博大泰克公司合成。

1.2 動(dòng)物模型和分組 6周齡、體質(zhì)量180～200 g的30只雄性SD大鼠［由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXX(豫)2010-0002］，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，選取其中一部分采用STZ 60 mg/kg一次性腹腔注射，48～72 h后空腹血糖維持在13.9 mmol/L，或隨機(jī)血糖16.7 mmol/L以上，視為糖尿病模型造模成功。4周后測(cè)定24 h尿蛋白定量在30 mg以上者，視為DN造模成功。將造模成功的16只DN大鼠隨機(jī)分為DN組(B組，n=8)和雷帕霉素組(C組，n=8)，并以8只正常大鼠作為對(duì)照組(A組，n=8)。C組給予雷帕霉素1 mg/(kg·d)灌胃，A組和B組以等量的0.5%羧甲基纖維素灌胃，每周稱體質(zhì)量調(diào)整用藥劑量。于第8周分別處死各組大鼠，處死前2 d收集24 h尿液;處死前稱體質(zhì)量;心臟取血標(biāo)本;腎組織稱質(zhì)量后，1/4腎組織用10%中性甲醛固定行HE、Masson染色，其余腎組織液氮保存待行RT-PCR及Western印跡檢測(cè)。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 生化檢測(cè) 血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、尿酸(UA)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、血糖采用全自動(dòng)生化檢測(cè)儀檢測(cè);尿白蛋白采用免疫比濁法檢測(cè)，尿Cr采用堿性苦味酸法檢測(cè)，計(jì)算尿白蛋白/ Cr比率(ACR，μg/μmol)。腎質(zhì)量指數(shù)(KWI，mg/ g)=腎質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。

1.3.2 病理學(xué)觀察 腎臟組織經(jīng)過(guò)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片后使用HE和PAS染色，在200倍光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織學(xué)變化;平均腎小球體積(MGV)按照文獻(xiàn)［3］公式計(jì)算:MGV(×106)=1.25 ×(腎小球截面積)3/2。

1.3.3 RT-PCR檢測(cè)VEGF mRNA的表達(dá) 用TRIzol試劑一步法抽提腎組織總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)總RNA濃度。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作程序合成cDNA。VEGF及β-actin引物由南京金斯特公司合成。PCR引物序列:β-actin引物上游:5'-CTGAACCCTAAGGCCAACC-3'，下 游:5'-CTGAACCCTAAGGCCAACC-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度309 bp;VEGF引物上游:5'-TGCTCCGTCGCTTGCTGCTT-3'，下游: 5'-GGCCATTAAAATCAGCTCTT-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度412 bp。VEGF和β-actin在同一反應(yīng)體系中的PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃3 min;然后進(jìn)入循環(huán):94℃變性30 s，57℃退火40 s，72℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán);反應(yīng)結(jié)束前72℃5 min以充分延伸。取PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳30 min。凝膠成像系統(tǒng)獲取圖片，凝膠圖像分析軟件檢測(cè)電泳圖像吸光值，以VEGF和內(nèi)參照β-actin的光密度之比作為檢測(cè)指標(biāo)的相對(duì)表達(dá)量，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.3.4 Western印跡檢測(cè)VEGF蛋白的表達(dá) 按總蛋白提取試劑盒和BCA法蛋白定量試劑盒說(shuō)明書，提取蛋白并定量，將50 μg腎皮質(zhì)的蛋白在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離，然后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂牛奶封閉1 h，加抗VEGF單抗(1∶50，TBS稀釋)，孵育4℃過(guò)夜，TBST洗一抗3次，加二抗(1∶100，TBS稀釋)，TBST洗二抗3次，ECL發(fā)光，顯影定影，采用膠片掃描后用Bandscan5.0軟件進(jìn)行灰度分析腎臟組織中VEGF的含量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般指標(biāo)比較 見表1。

表1 各組大鼠一般指標(biāo)比較(±s)

表1 各組大鼠一般指標(biāo)比較(±s)

注:與A組比較，*P＜0.05，△P＜0.01;與B組比較，#P＜0.05

項(xiàng)目 A組(n=8) B組(n=8) C組(n=8)血糖(mmol/L) 5.10±0.85 27.75±4.64△ 25.60±2.20△BUN(mmol/L) 4.50±0.48 11.92±1.59△ 9.12±2.01△Cr(μmol/L) 46.57±3.92 89.45±10.57* 79.65±5.88* TC(mmol/L) 0.92±0.28 2.41±0.35* 2.43±0.24* TG(mmol/L) 0.69±0.36 1.68±0.24* 1.54±0.14* ACR(μg/μmol) 55.53±8.01 175.95±12.34△ 67.80±9.92# KWI(mg/g) 5.41±0.89 9.41±0.76△ 7.23±1.19*# MGV(×106，μm3) 1.32±0.22 3.84±0.26△ 1.38±0.27#

2.2 各組大鼠腎臟病理改變 腎組織染色(HE和PAS染色)顯示，與A組大鼠比較，B、C組腎小球直徑明顯增大，系膜基質(zhì)增多，毛細(xì)血管管腔變窄，腎間質(zhì)可見灶性淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)。與B組比較，C組大鼠系膜基質(zhì)增生減輕，毛細(xì)血管袢開放良好，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，腎小球直徑偏小。見插頁(yè)Ⅱ圖10。

2.3 各組大鼠腎組織VEGF mRNA表達(dá) A組大鼠腎組織中VEGF mRNA有微量表達(dá);與A組(0.24±0.12)比較，B組(1.29±0.31)和 C組(0.68±0.24)大鼠腎組織VEGF mRNA表達(dá)上調(diào)(P＜0.05);與B組比較，C組大鼠腎組織VEGF mRNA表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)。見圖1。

圖1 RT-PCR檢測(cè)VEGF mRNA的表達(dá)

2.4 各組大鼠腎組織VEGF蛋白表達(dá) Western印跡檢測(cè)結(jié)果表明，大鼠腎組織VEGF蛋白在A組呈低表達(dá)，而B組和C組高表達(dá)，見圖2。半定量分析結(jié)果顯示，A組大鼠腎組織VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.18±0.09，B組為0.92±0.17，C組為0.56± 0.14，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖2 3組腎組織VEGF蛋白的表達(dá)

2.5 大鼠腎組織VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量與Cr、ACR的相關(guān)性分析 VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量與ACR、Cr均呈正相關(guān)(r=0.816，P＜0.01;r=0.716，P＜0.01)。

3 討論

在許多國(guó)家，DN已成為終末期腎病的首要原因，早期干預(yù)DN以及腎保護(hù)極為重要。大量研究表明，VEGF參與了DN的發(fā)生和發(fā)展，VEGF與其受體結(jié)合后可促進(jìn)腎系膜合成膠原等物質(zhì)，使細(xì)胞外基質(zhì)聚集，最終導(dǎo)致腎纖維化［4］。

VEGF在腎臟是由足細(xì)胞分泌和合成的，通過(guò)與內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體結(jié)合，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和分化，增加毛細(xì)血管通透性和增加血管新生［5］。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)［6］，在早期糖尿病狀態(tài)下，腎臟組織VEGF表達(dá)上調(diào)。在本實(shí)驗(yàn)中，同樣觀察到DN組和雷帕霉素組腎臟組織VEGF蛋白及mRNA表達(dá)均上調(diào)，顯著高于對(duì)照組，而且VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量與ACR及Cr呈正相關(guān)。據(jù)此推測(cè)，腎臟組織中高表達(dá)的VEGF可促進(jìn)腎小球內(nèi)毛細(xì)血管袢增生，增加濾過(guò)膜的通透性，從而導(dǎo)致尿蛋白增加。雷帕霉素組腎臟組織VEGF蛋白及mRNA表達(dá)雖然也上調(diào)，但顯著低于DN組。由此看出，雷帕霉素具有腎保護(hù)作用，這與Piecha等［7］研究結(jié)果相符，同時(shí)也提示其腎保護(hù)的機(jī)制可能是通過(guò)抑制VEGF的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，但其確切的機(jī)制尚未完全清楚。在本研究中，雷帕霉素組和DN組大鼠血糖水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可見雷帕霉素這種腎保護(hù)作用不是通過(guò)對(duì)血糖的調(diào)控來(lái)影響疾病進(jìn)程的。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，8周末DN組大鼠和雷帕霉素組大鼠均出現(xiàn)腎臟肥大，表現(xiàn)為體質(zhì)量指數(shù)明顯增大，MGV較對(duì)照組顯著增大。由此證實(shí)，早期DN病理的主要改變?yōu)槟I小球肥大，從病理也可看出，包括有腎臟固有細(xì)胞增殖和細(xì)胞體積增大，以及系膜基質(zhì)增生。經(jīng)過(guò)低劑量雷帕霉素干預(yù)后，雷帕霉素組腎小球肥大較DN組改善。在本研究中，我們從形態(tài)學(xué)的角度發(fā)現(xiàn)雷帕霉素可顯著抑制DN大鼠早期腎小球肥大，這可能與雷帕霉素下調(diào)VEGF的表達(dá)有關(guān)。Sakaguchi等［8］研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素可通過(guò)抑制p70S6激酶的磷酸化，下調(diào)p20［ip］和p27［ip］的表達(dá)，抑制近端小管上皮的肥大。在Lloberas等［9］研究中雷帕霉素組織mTOR信號(hào)通路后可延緩DN的發(fā)展，但未觀察到腎小球肥大被抑制的現(xiàn)象。這一矛盾的產(chǎn)生可能與雷帕霉素的藥物劑量、給藥途徑和干預(yù)時(shí)間等有關(guān)，還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

綜上所述，STZ誘導(dǎo)的DN大鼠腎皮質(zhì)VEGF表達(dá)增多，可導(dǎo)致腎小球肥大，造成腎損傷。低劑量雷帕霉素通過(guò)抑制VEGF的高表達(dá)，減少系膜基質(zhì)增生、改善腎小球肥大、減少尿白蛋白的排泄，從而達(dá)到腎臟保護(hù)的作用。有關(guān)雷帕霉素對(duì)腎臟保護(hù)的作用機(jī)制，目前尚未十分清楚，仍需要進(jìn)一步更深入廣泛的基礎(chǔ)和臨床研究。

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