薛 敏，周 玲

(1徐州醫(yī)學(xué)院，江蘇徐州221000;2徐州市婦幼保健院)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)惡性腫瘤之一，也是病死率最高的婦科惡性腫瘤。其中卵巢上皮癌最為多見(jiàn)［1～3］。具有酪氨酸蛋白激酶活性的c-Src家族成員已被證明在調(diào)控細(xì)胞生存、增生、黏附、運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面發(fā)揮重要作用［4］。在肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌和胰腺癌等很多腫瘤組織中都存在c-Src蛋白的過(guò)表達(dá)［5］。c-Src在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起著樞紐作用，可以被多條信號(hào)通路活化，同時(shí)也可以激活多條信號(hào)通路，其中和腫瘤生成密切相關(guān)的信號(hào)通路 PTEN/PI3K/Akt/GSK-3β一直倍受關(guān)注。我們于2009年1月～2010年8月進(jìn)行本研究，擬探討c-Src蛋白對(duì)人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞活性的影響及其可能作用機(jī)制，主要觀察c-Src基因敲除對(duì)SKOV-3細(xì)胞c-Src蛋白表達(dá)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞活性及血管生成相關(guān)蛋白血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)的影響，為進(jìn)一步闡明卵巢癌發(fā)生發(fā)展機(jī)理提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)資料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、藥品和設(shè)備 人卵巢癌細(xì)胞SKOV-3購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，接種在含10%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料研究所。流式細(xì)胞儀(Coulter Epics XL):美國(guó) Beckman-Coulter公司。CO2培養(yǎng)箱(MCO-15AC):日本三洋公司。脂質(zhì)體LipofectamineTM2000為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品;c-Src siRNA由上海吉瑪制藥公司合成;總RNA提取試劑TRIzol購(gòu)自Invitrogen公司;十二烷基磺酸鈉(SDS)購(gòu)自Fluka公司;兔抗人c-Src蛋白多克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG為Santa Cruz公司產(chǎn)品;增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3接種于含10%滅活新生牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，混合度達(dá)85%左右時(shí)，用1.25 g/L的胰酶消化傳代。c-Src mRNA的siRNA的轉(zhuǎn)染:細(xì)胞3×105個(gè)/孔接種于6孔板內(nèi)，次日細(xì)胞融合度為40%～60%時(shí)，吸棄上清液，終體積為2 mL，將siRNA-LipofectamineTM2000復(fù)合體(復(fù)合體的配制按說(shuō)明書(shū)操作)加到培養(yǎng)板中，轉(zhuǎn)染體系為500 μL，siRNA終濃度為50 nmol/L，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組。繼續(xù)放入37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 siRNA的設(shè)計(jì)制備 由WMG和Qigen兩種siRNA在線設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)針對(duì)c-Src mRNA的siRNA，c-Src mRNA序列來(lái)自NCBI(NM_001127190.1，GI:187475372)，siRNA滿足G/C含量＜50%，且在正、反義3'端分別有2個(gè)TT游離堿基。以上siRNA序列均通過(guò)Blast比對(duì)，證實(shí)與人類(lèi)基因外顯子沒(méi)有同源性。所有 siRNA均由上海吉瑪公司合成和PAGE純化，c-Src siRNA序列如下:正義鏈:5'-CAAGAGCAAGCCCAAGGAUTT-3'，反義鏈:5'-AUCCUUGGGCUUGCUCUUGTT-3';陰性對(duì)照siRNA序列如下:正義鏈:5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，反義鏈:5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。

1.4 real-time PCR檢測(cè)c-Src基因mRNA的表達(dá)①引物的設(shè)計(jì):應(yīng)用Primer Premier5.10軟件設(shè)計(jì)，掃描人類(lèi)基因庫(kù)中未發(fā)現(xiàn)的其他同源。②Src:上游引物:5'-CACTCGCTCAGCACAGGACAG-3'，下游引物:5'-AGAGGCAGTAGGCACCTTTCG-3'，產(chǎn)物片段為196 bp;β肌動(dòng)蛋白(β-actin):上游引物:5'-GTGGTGGTGAAGCTGTAGCC-3'，下游引物:5'-GAGACCTTCAACACCCC-3'，產(chǎn)物片段為230 bp。③RNA含量及純度測(cè)定:收集實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞，分別提取總RNA，測(cè)定RNA含量及純度。④RT反應(yīng):20 μL反應(yīng)體系，按照RT試劑盒操作步驟進(jìn)行，合成cDNA。⑤PCR反應(yīng):20 μL反應(yīng)體系，95℃預(yù)變性3 min;94℃ 45 s，55℃30 s，72℃ 45 s，共30個(gè)循環(huán);72℃充分延伸7 min，結(jié)束溫度為4℃。⑥結(jié)果與計(jì)算:各樣品的目的基因和管家基因分別進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)。根據(jù)繪制的梯度稀釋DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線，各樣品目的基因和管家基因的濃度結(jié)果直接生成。每個(gè)樣品的目的基因濃度除以其管家基因的濃度，即為此樣品此基因的校正后的相對(duì)含量。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)周期 人卵巢癌細(xì)胞SKOV-3以3×105個(gè)/孔細(xì)胞數(shù)接種于6孔板中，37℃5%CO2培養(yǎng)，次日更換不含10%FBS的純培養(yǎng)基，進(jìn)行血清饑餓使細(xì)胞同步化，16～18 h后更換含10%FBS的完全培養(yǎng)基恢復(fù)細(xì)胞，14～16 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別于轉(zhuǎn)染后48 h，常規(guī)胰酶消化后，預(yù)冷的PBS(pH 7.4)洗滌2次，75%乙醇固定，PBS再次洗滌，加入1%Triton X-100 1 mL作用10 min，0.01%RNA酶1 mL處理10 min，最后以0.25%碘化丙啶(PI)染色20 min后，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期的分析。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)上清中VEGF的分泌 卵巢癌細(xì)胞SKOV-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h后收集細(xì)胞上清，ELISA檢測(cè)VEGF蛋白分泌。VEGFELISA試劑盒購(gòu)于Bender Med-Sytems公司，采用雙抗體夾心ELISA法，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作。應(yīng)用BIORAD3550-UV型酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm條件下讀取光密度值(OD值)，計(jì)算機(jī)自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得出各組的VEGF的水平。

1.7 Western blot檢測(cè)c-Src蛋白以及VEGF蛋白表達(dá)情況 卵巢癌細(xì)胞SKOV-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞后提取總蛋白，常規(guī)胰酶消化，收集細(xì)胞沉淀，按每1×105細(xì)胞加200 μL細(xì)胞裂解液，混勻，置冰上充分裂解，12 000 r/min離心5min，取上清，考馬斯亮蘭法測(cè)定蛋白含量。取待測(cè)樣品與6×蛋白上樣緩沖液按1∶5混勻后煮沸5 min冷卻，每個(gè)泳道加入20 μg樣品，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，1%BSA液封閉，4℃過(guò)夜，一抗室溫孵育2 h，TBST液漂洗，二抗室溫孵育1 h，TBST液漂洗3次，避光條件下加入堿性磷酸酶顯色液進(jìn)行顯色，經(jīng)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行光密度掃描分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)以±s表示，行t檢驗(yàn)，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 c-Src基因表達(dá) real-time PCR顯示:在干擾48 h后，轉(zhuǎn)染 siRNA-Src組細(xì)胞 SKOV-3內(nèi) c-Src mRNA表達(dá)減弱明顯，為0.017±0.006，與空白對(duì)照組(0.053±0.008)及陰性對(duì)照組(0.061± 0.008)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組中c-Src mRNA表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，表明轉(zhuǎn)入陰性對(duì)照siRNA不會(huì)影響c-Src mRNA的表達(dá)。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果 轉(zhuǎn)染siRNA-Src組細(xì)胞S期(9.72%)低于陰性對(duì)照組(15.30%)和空白對(duì)照組(16.33%)，表明c-Src能夠一定程度地促進(jìn)SKOV-3的細(xì)胞周期向S期轉(zhuǎn)換，驗(yàn)證c-Src在卵巢癌細(xì)胞SKOV-3細(xì)胞增殖中發(fā)揮一定作用。

2.3 ELISA及Western blot檢測(cè)結(jié)果 轉(zhuǎn)染siRNASrc組的卵巢癌細(xì)胞SKOV-3上清中VEGF的表達(dá)明顯下降，為 3.087±1.458，低于陰性對(duì)照組(9.125+1.703，P＜0.01)和空白對(duì)照組(9.183± 2.965，P=0.021 7)。Western blot結(jié)果見(jiàn)圖1，顯示轉(zhuǎn)染siRNA-Src組的細(xì)胞除了c-Src蛋白表達(dá)量明顯下降外，VEGF的表達(dá)量也明顯下降。

圖1 Western blot檢測(cè)結(jié)果

3 討論

RNAi技術(shù)是內(nèi)源或外源雙鏈RNA(dsRNA)進(jìn)入細(xì)胞后降解為2l～25個(gè)核苷酸組成siRNA，誘導(dǎo)同源特異性mRNA降解，使特異性蛋白合成減少，從而導(dǎo)致特定基因沉默(PTGS)［6］。目前RNAi已逐漸應(yīng)用于基因功能檢測(cè)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑分析、冗余基因確定和基因治療等研究。

c-Src蛋白作為眾多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路過(guò)程中的樞紐，參與許多調(diào)節(jié)細(xì)胞增生和浸潤(rùn)以及生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路。目前發(fā)現(xiàn)的已有9個(gè)，即由Src、yes、lyn、fyn、lck、blk、fgr、hck和yrk原癌基因編碼的產(chǎn)物組成，這些產(chǎn)物都有酪氨酸蛋白激酶活性。其編碼的非受體蛋白酪氨酸激酶，分子量為60 kD。Src蛋白質(zhì)產(chǎn)物由N端、Src同源域(SH)、激酶域和C端組成，SH從羧基端至氨基端依次命名為SH1、SH2、 SH3、SH4，其中SH1為酪氨酸蛋白激酶功能域，酶活性中心，有典型的酪氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)，ATP結(jié)合區(qū)和自身磷酸化位點(diǎn);SH2和SH3是c-Src家族參與大分子之間作用和傳遞信號(hào)的分子基礎(chǔ);SH4與Src細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)面的定位密切相關(guān)。

目前，c-Src基因在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中分子機(jī)制的研究很少。雖然有研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌中c-Src基因mRNA表達(dá)水平的上調(diào)與p53基因的靜息有關(guān)，可能通過(guò)影響p53基因的功能在惡性腫瘤的進(jìn)展中發(fā)揮作用;c-Src能和內(nèi)皮細(xì)胞表面的VEGF受體相互作用，刺激內(nèi)皮細(xì)胞增生;在肺腺癌A549細(xì)胞中，抑制c-Src酪氨酸激酶能夠抑制體外增殖和浸潤(rùn)。然而，c-Src基因確切的分子作用機(jī)制還很不清楚。而腫瘤在生長(zhǎng)過(guò)程中，由于生長(zhǎng)速度過(guò)快，缺氧是卵巢上皮性癌血管生成擬態(tài)的主要誘導(dǎo)因素之一。在缺氧狀態(tài)下，正常內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制，無(wú)法為腫瘤生長(zhǎng)提供足夠血供，因此能為腫瘤的生長(zhǎng)提供養(yǎng)分和轉(zhuǎn)移途徑的腫瘤血管成為治療腫瘤的重要靶點(diǎn)之一，也越來(lái)越受到更多的學(xué)者的研究和重視。為了進(jìn)一步研究抑制c-Src酪氨酸激酶對(duì)卵巢癌細(xì)胞血管生成能力的影響，本研究通過(guò)卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA-Src后，ELISA檢測(cè)上清中VEGF的表達(dá)明顯下降;免疫印跡法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染siRNA-Src后，卵巢癌細(xì)胞SKOV-3細(xì)胞中隨著c-Src蛋白表達(dá)量的下降，VEGF的表達(dá)也明顯降低。而使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期亦發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染siRNA-Src明顯抑制了卵巢癌細(xì)胞SKOV-3向S期的轉(zhuǎn)化，抑制細(xì)胞的增殖。以上結(jié)果均表明:在卵巢癌細(xì)胞SKOV-3的增殖與血管生成過(guò)程中，c-Src蛋白起著至關(guān)重要的作用。

［1］Iorio MV，Visone R，Di Leva G，et al.MicroRNA signatures in human ovarian cancer［J］.Cancer Res，2007，67(18):8699-8707.

［2］Taylor DD，Gercel-Taylor C.MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer［J］.Gynecol Oncol，2008，110(1):13-21.

［3］Zhang L，Volinia S，Bonome T，et al.Genomic and epigenetic alterations deregulate microRNA expression in human epithelial ovarian cancer［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(19): 7004-7009.

［4］Aleshin A，F(xiàn)inn RS.SRC:a century of science brought to the clinic［J］.Neoplasia，2010，12(8):599-607.

［5］Masaki T，Igarashi K，Tokuda M，et al.pp60c-src activation in lung adenocarcinoma［J］.Eur J Cancer，2003，39(10): 1447-1455.

［6］Agami R.RNAi and related mechanisms and their potential use for therapy［J］.Curr Opin Chem Biol，2002，6(6):829-834.