徐 健，項(xiàng)洪剛，易 偉，查思洛

(第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院，上海200003)

反映區(qū)域淋巴結(jié)侵犯情況的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比率(LNR)是影響大腸癌預(yù)后的ⅠA類決定因子［1］，也是判斷是否行術(shù)后輔助治療的主要依據(jù)。大腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散是一個(gè)涉及多因素、多階段的復(fù)雜過程，已有的研究表明基質(zhì)金屬蛋白酶-9［2］(MMP-9)和nm23［3］分別可能具有對腫瘤轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)受侵的促進(jìn)或保護(hù)作用。本研究以人結(jié)腸癌組織為對象，通過免疫組化染色觀察分析nm23和MMP-9的表達(dá)，綜合分析二者與LNR的關(guān)系，以期能更好的評判LNR的風(fēng)險(xiǎn)度。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 2007年1月～2011年12月第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院結(jié)直腸外科收治并經(jīng)病理診斷的結(jié)腸癌患者567例?；颊呔鶠槭状谓邮苁中g(shù)治療，入選病例至少有1枚淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性，且送檢淋巴結(jié)數(shù)達(dá)12枚以上，剔除術(shù)前放化療病例。其中男366例、女201例，年齡23～92歲、中位年齡62歲。腫瘤分級(jí)按WHO分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ級(jí)(高分化)238例，Ⅱ級(jí)(中分化)256例，Ⅲ級(jí)(低分化或未分化)73例。送檢淋巴結(jié)12～48(14.49±8.68)枚。收集患者性別、年齡及其病理資料等。

1.2 組織芯片免疫組化染色

1.2.1 組織芯片的制備 委托上海芯超生物科技有限公司使用組織陣列儀(美國Beecher公司)制作結(jié)腸癌組織芯片，操作流程按收集標(biāo)本、取材、脫水、石蠟包埋、4 μm切片、HE染色標(biāo)記和芯片制作處理。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色采用二步法 鼠抗人單克隆抗體 nm23(No:MAB-0139)和 MMP-9(No: MAB-0245)及二步法免疫組化試劑盒均購自福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。每次實(shí)驗(yàn)均以已知的陽性組織切片作為陽性對照，以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照，DAB顯色。

1.2.3 陽性結(jié)果判斷 用Mattern積分法［4］染色指數(shù)來評定陽性細(xì)胞百分率:每例隨機(jī)觀察5個(gè)高倍鏡視野(×400):無陽性表達(dá)細(xì)胞為0分;＜50% 為1分;50% ～75%為2分;＞75%為3分。染色強(qiáng)度:0為不著色;1為淺黃色;2為深黃色;3為棕黃色。染色指數(shù)為陽性細(xì)胞百分率和染色強(qiáng)度之和。陽性表達(dá)指數(shù)＞3定為免疫組化染色陽性;≤3定為陰性。

1.3 LNR 將LNR(陽性淋巴結(jié)數(shù)/全部被檢淋巴結(jié)數(shù) ×100%)分為:LNR0(0)，LNR1(＜10%)，LNR2(10%～25%)，LNR3(＞25%)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料組間采用χ2檢驗(yàn)，多個(gè)變量相關(guān)性采用Spearman＇s等級(jí)相關(guān)分析，以P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌nm23和MMP-9的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系 結(jié)腸癌nm23和MMP-9陽性表達(dá)產(chǎn)物呈棕黃色，主要定位于細(xì)胞質(zhì)，呈彌漫分布，見插頁Ⅰ圖7、8，陽性表達(dá)率分別為51.9%和55.0%。兩者表達(dá)差異與患者的性別、年齡無關(guān)(P＞0.05)。但低分化、浸潤至漿膜層/淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高和有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，nm23表達(dá)陽性率明顯較低，而MMP-9表達(dá)陽性率則較高。結(jié)果表明nm23和MMP-9的表達(dá)與腫瘤分級(jí)程度、腸壁浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率及有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

2.2 nm23和 MMP-9的表達(dá)與 LNR的關(guān)系

Spearman相關(guān)分析顯示，LNR和腫瘤原發(fā)灶nm23表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=－0.561，P＜0.05)，LNR與MMP-9表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.569，P＜0.05)。并且nm23和MMP-9的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=－0.434，P＜0.05)。

表1 nm23、MMP-9表達(dá)和結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

結(jié)腸癌術(shù)后病理的LNR是判斷患者預(yù)后的重要獨(dú)立預(yù)后因子，也是確定術(shù)后輔助治療的主要依據(jù)［5］。美國癌癥聯(lián)合會(huì)和美國病理學(xué)家協(xié)會(huì)建議至少需檢出12枚淋巴結(jié)以上才能較為準(zhǔn)確判斷結(jié)腸癌的LNR。Wang等［6］的研究發(fā)現(xiàn)，LNR是獨(dú)立的生存影響因子，優(yōu)于淋巴結(jié)陽性數(shù)預(yù)測預(yù)后，更是Ⅲ期結(jié)腸癌準(zhǔn)確的預(yù)后監(jiān)測指標(biāo)。但是由于目前病理手段的局限性和存在病理醫(yī)師個(gè)人經(jīng)驗(yàn)的差異性，我們尚不能做到對所有患者LNR的精確判斷，尤其是對于常規(guī)HE染色難以發(fā)現(xiàn)的淋巴結(jié)內(nèi)單個(gè)轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞或轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞團(tuán)直徑≤2 mm的微小轉(zhuǎn)移。這就很可能導(dǎo)致對LNR的誤判，以至于影響腫瘤分期和后續(xù)輔助治療的決策，因此如何采用其他手段聯(lián)合病理結(jié)果來取得較為精確的LNR，是擺在外科和腫瘤科臨床醫(yī)師面前的一個(gè)較為重要的課題。

目前針對nm23基因［7］的研究比較廣泛。它包括nm23-H1和nm23-H2。以往的研究表明，它編碼的產(chǎn)物對癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力和轉(zhuǎn)移潛能有抑制作用［8］，結(jié)腸癌和惡性黑色素瘤等的轉(zhuǎn)移與nm23蛋白表達(dá)低下有關(guān)，其中的機(jī)理可能是通過nm23蛋白產(chǎn)物二磷酸核苷激酶(NDPK)，參與體內(nèi)高能磷酸鍵轉(zhuǎn)移，促進(jìn)細(xì)胞分裂，參與G蛋白介導(dǎo)的信號(hào)傳遞，影響細(xì)胞內(nèi)微管的聚合和解聚來影響腫瘤細(xì)胞的活性。本研究顯示，低分化、浸潤至漿膜層、LNR高和有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者nm23表達(dá)陽性率明顯較低，而且nm23的陽性表達(dá)率和LNR存在顯著的負(fù)相關(guān)，表明nm23對大腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有明顯抑制作用。

MMP-9是MMPs家族中的重要成員，其分子量最大，是Ⅳ型膠原酶，能夠降解、破壞細(xì)胞外基質(zhì)中最主要的成分Ⅳ型膠原、Ⅴ型膠原和明膠。大量研究表明，腫瘤轉(zhuǎn)移浸潤的潛能與腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生MMP-9的能力有著密切的正相關(guān)關(guān)系，對腫瘤的黏附和能動(dòng)性有影響。在胃癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤中均有MMP-9的顯著增高。這與本實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果相一致，低分化、浸潤至漿膜層、LNR高和有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者中MMP-9表達(dá)陽性率明顯高于對照組。同樣LNR與腫瘤原發(fā)灶MMP-9表達(dá)呈顯著正相關(guān)，而且nm23和MMP-9的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

總之，通過本研究，我們推測大腸癌nm23表達(dá)缺失和MMP-9過高表達(dá)在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的早期階段就已發(fā)揮作用。因此對于 LNR0的大腸癌患者(Dukes A、B)原發(fā)灶中nm23和MMP-9聯(lián)合檢測有望成為評估LNR風(fēng)險(xiǎn)度的有用指標(biāo)，并對臨床制定治療術(shù)后輔助措施和判斷預(yù)后有重要指導(dǎo)意義。

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