周 耀，豐 來，周 政

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南 長沙 410128）

藤茶，俗稱茅巖莓茶、端午茶、藤婆茶，學(xué)名顯齒蛇葡萄（A.grossedentata），為葡萄科，蛇葡萄屬木質(zhì)藤本。它是粵蛇葡萄（A.cantoniesi）的變種，主要分布于廣東、廣西、云南、貴州、湖南、湖北、江西、福建等省[1]。藤茶中主要活性成分二氫楊梅素在該植物幼嫩芽頭部位含量最高[2]。二氫楊梅素（3，5，7，3′4′5′-六羥基-2,3 雙氫黃酮醇 dihydromyricetin，DMY）是一種多酚羥基雙氫黃酮醇，又稱蛇葡萄素，屬黃酮類化合物[3]。二氫楊梅素除具有黃酮化合物的清除自由基、抗氧化、抗血栓、抗腫瘤、消炎抑菌等普通特性外，其在解除醇中毒、降低血脂和血糖水平，提高SOD活性以及保肝護(hù)肝等方面具有特殊功效，具有明顯拮抗Na和高K所致的兔胸主動(dòng)脈條收縮反應(yīng)及鈣拮抗作用，且毒性低，可作為抗心律失常、心肌缺血、高血壓的新型藥物[4]。試驗(yàn)采用高效液相色譜法（HPLC）測定藤茶嫩葉、葉片、老葉、果實(shí)、愈傷組織、懸浮培養(yǎng)液中二氫楊梅素的含量，重點(diǎn)探討了愈傷組織培養(yǎng)法生產(chǎn)二氫楊梅素的可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 儀 器 Agilent 1100 Series高效液相色譜儀，L 27420紫外可見光檢測器，BF22002色譜工作站，AL204萬分電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

1.1.2 試 劑 二氫楊梅素對(duì)照品（色譜級(jí)，純度>98%）；甲醇（色譜純）；超純水；其它試劑均為分析純。

1.1.3 材 料 供試材料藤條，春天采自湖南省張家界，移栽到湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)基地。9月中旬采集3種葉片，10月底采集果實(shí)，均于48℃烘干，粉碎過60目篩備用。

愈傷組織培養(yǎng)選擇植株生長健狀，無病蟲害的藤茶葉片、葉柄、莖段、莖尖等作為外植體。取長勢(shì)良好、無染菌、黑斑較少的愈傷組織，48℃烘干粉碎，過60目篩備用。

懸浮細(xì)胞培養(yǎng)選擇愈傷培養(yǎng)繼代3次后，狀態(tài)疏松、生長速度快的愈傷組織轉(zhuǎn)入到液體培養(yǎng)基中[5]。選擇鏡檢有一定活細(xì)胞數(shù)量的同批懸浮液過濾，液體混合備用。

1.1.4 培養(yǎng)基 愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L+蔗糖2%+瓊脂 0.7%；繼代培養(yǎng)基：MS+2，4-D 2mg/L+蔗糖 2%+瓊脂 0.7%；懸浮培養(yǎng)基：MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖2%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 液相色譜條件 參照周雪仙等[5-6]方法，C18柱，流動(dòng)相為甲醇∶水（36∶64），應(yīng)用前經(jīng)過 0.45 μm微孔濾膜抽濾，超聲脫氣，流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣時(shí)為 20 μL，柱溫 30℃；檢測波長 291 nm。

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備與計(jì)算[7]取二氫楊梅素對(duì)照品5 mg，加水溶解并定容至50 mL，搖勻，即得（0.1mg/1mL）,0.45 μm 微孔濾膜過濾，取 20 μL 進(jìn)樣，面積外標(biāo)法定量。計(jì)算方法：

X=[A樣×C標(biāo)×B樣/（A標(biāo)×M）]×100%

式中：X——樣品中二氫楊梅素含量（%）；A樣——樣品圖譜中二氫楊梅素對(duì)應(yīng)的峰面積；A標(biāo)——對(duì)照品圖譜中二氫楊梅素對(duì)應(yīng)的峰面積；C標(biāo)——二氫楊梅素對(duì)照品的濃度（mg/mL）為0.1；B樣——溶液稀釋倍數(shù)；M——樣品量（mg或mL）

1.2.3 供試液制備 嫩葉、葉片、老葉、果實(shí)、愈傷組織各稱取樣品粉末1 g，置250 mL三角燒瓶中，加20倍水于97℃水浴30 min，10 000 r/min離心5 min，取上清液備用，沉淀重復(fù)上述操作兩次，合并3次離心后的上清液，10倍95%乙醇沉淀，10 000 r/min離心5 min，留上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至50 mL，精密量取濃縮液1 mL，根據(jù)預(yù)作試驗(yàn)分別定容到適當(dāng)體積。超聲30 min，取適量用0.45 μm微孔濾膜過濾即得樣品溶液，取20 μL進(jìn)樣分析。

細(xì)胞懸浮液量取200 mL，10倍95%乙醇沉淀，10 000 r/min離心5 min，留上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮50 mL，精密量取濃縮液1 mL，定容到5 mL。超聲30 min，取適量用0.45 μm微孔濾膜濾過即得樣品溶液。取20 μL進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 二氫楊梅素對(duì)照品的測定

由圖1可知，二氫楊梅素對(duì)照品大約在7.5 min開始出現(xiàn)峰，大約在8.5 min時(shí)出峰，響應(yīng)時(shí)間7.828 min，峰面積為 3 849 165，高度為 268 796。即A標(biāo)為3 849 165，C標(biāo)為0.1 mg/mL。

圖1 二氫楊梅素對(duì)照品HPLC圖譜

2.2 藤條嫩葉中二氫楊梅素含量的測定

將1.2.3中量取的1 mL溶液定溶到10 mL，然后過膜上樣。由圖2可知，嫩葉二氫楊梅素響應(yīng)時(shí)間7.902 min，峰面積A樣為19 652 356，高度為1 102 075。稀釋倍數(shù)B樣為50×10=500，求得X，即嫩葉中二氫楊梅素含量為25.528%。

圖2 藤條嫩葉二氫楊梅素HPLC圖譜

2.3 藤條葉片中二氫楊梅素含量的測定

將1.2.3中量取的1 mL溶液定溶到5 mL，然后過膜上樣。由圖3可知，葉子二氫楊梅素響應(yīng)時(shí)間7.944 min，峰面積A樣為21 106 641，高度為11 589 752。稀釋倍數(shù)B樣為50×5=250，求得X，即葉片中二氫楊梅素含量為13.709%。

圖3 藤條葉片二氫楊梅素HPLC圖譜

2.4 藤條老葉中二氫楊梅素含量的測定

將1.2.3中量取的1 mL溶液定溶到50 mL，然后過膜上樣。由圖4可知，老葉二氫楊梅素響應(yīng)時(shí)間7.980 min，峰面積A樣為2 053 457，高度為144 301。稀釋倍數(shù) B 樣為 50×50=2 500，求得 X，即老葉中的二氫楊梅素含量為13.337%。

圖4 藤條老葉二氫楊梅素HPLC圖譜

2.5 藤條果實(shí)中二氫楊梅素含量的測定

將2.1.4中量取的1 mL溶液定溶到5 mL，然后過膜上樣。由圖5可知，果實(shí)二氫楊梅素響應(yīng)時(shí)間7.936 min，峰面積A樣為9 630 913，高度為649 830。稀釋倍數(shù)B樣為50×5=250，求得X，即果實(shí)中二氫楊梅素含量為6.255%。

圖5 藤條果實(shí)二氫楊梅素HPLC圖譜

2.6 藤條愈傷組織物中二氫楊梅素含量的測定

將1.2.3中量取的1 mL溶液定溶到10 mL，然后過膜上樣。由圖6可知，愈傷二氫楊梅素響應(yīng)時(shí)間7.999 min，峰面積A樣為8 942 537，高度為592 680。稀釋倍數(shù)B樣為50×10=500，求得X，即愈傷中二氫楊梅素含量為11.616%。

圖6 藤條愈傷組培物二氫楊梅素HPLC圖譜

2.7 藤條細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液中二氫楊梅素含量的測定

由圖7可知，懸浮液二氫楊梅素響應(yīng)時(shí)間8.027 min，峰面積A樣為255 303，高度為11 440。稀釋倍數(shù)B樣為50×5=250，因?yàn)閼腋∫菏侨〉?00 mL，所以M是200，求得X，即懸浮液中二氫楊梅素含量為0.829%。

圖7 藤條細(xì)胞懸浮液二氫楊梅素HPLC圖譜

3 討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，愈傷組織中二氫楊梅素含量與葉子中二氫楊梅素含量接近，可能是生長力旺盛的組織合成二氫楊梅素能力強(qiáng)，而懸浮液與愈傷組織中的二氫楊梅素含量相距很大，推測該次生代謝物的合成對(duì)組織的活性存在很大的依賴性，由于愈傷組織尚具備誘導(dǎo)分化的能力，而懸浮細(xì)胞已完全喪失細(xì)胞分化能力的潛力，推測二氫楊梅素的合成與促進(jìn)細(xì)胞分化的因素相關(guān)。試驗(yàn)說明愈傷組織誘導(dǎo)分化能力較強(qiáng)。利用愈傷組織培養(yǎng)生產(chǎn)二氫楊梅素值得進(jìn)一步深入研究。

[1]Liu J X ，Zhou T O.A pharmacognostical study on“Tengcha”，Bigdentata Ampelopsis（Ampelopsis grossedentata）.Chinese Tradition Herb Drugs，1999，30（6）：459-463.

[2]張友勝，楊偉麗，熊皓平.RP-HPLC法測定顯齒蛇葡萄植物中楊梅素的含量[J].中草藥，2001，32（11）：983-985.

[3]魏 捷.紫外分光光度法測定顯齒蛇葡萄各部分蛇葡萄素含量[J].海峽藥學(xué)，2002，14（5）：62.

[4]何桂霞，裴 剛，周天達(dá)，等.顯齒蛇葡萄中總黃酮和二氫楊梅素的含量測定[J].中國中藥雜志，2000，25（7）：423-425.

[5]王晶晶，蔡 赫，李然紅，等.非洲鳳仙花細(xì)胞懸浮培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J].牡丹江師范學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，68（3）：13-14.

[6]何桂霞，裴 剛，楊偉麗，等.HPLC測定藤茶不同采收時(shí)期及不同部位的二氫楊酶素含量[J].中成藥，2004，26（3）：210-212.

[7]王春娥，潘振球，馮家力，等.HPLC法測定保健食品中二氫楊梅素的研究[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2006，16（6）：694，732.