李燕凌，張 文，張新宇，李大志

（1.湖南省蔬菜研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

番茄潰瘍?。╞acterial canker of tomato）是由密歇根棒形桿菌密歇根亞種（Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis，Cmm）引起的一種毀滅性細(xì)菌病害。該病害自從1909年首次在美國(guó)溫室番茄上發(fā)現(xiàn)以來(lái)，發(fā)生頻繁，主要通過(guò)帶菌種子和種苗遠(yuǎn)距離傳播，現(xiàn)已廣泛分布于世界各番茄產(chǎn)區(qū)，我國(guó)于1985年首次在北京市發(fā)現(xiàn)番茄潰瘍病并報(bào)道。我國(guó)已成為世界上最重要的番茄制種基地之一，隨著國(guó)際間日益頻繁的種質(zhì)交換和種子貿(mào)易，近年來(lái)番茄潰瘍病成為我國(guó)番茄生產(chǎn)的巨大潛在威脅。湖南高溫高濕的氣候條件更適宜于病害的流行，該病害一般于5～7月發(fā)生，湖南城步縣等高山地區(qū)主要在7～8月爆發(fā)[1]，嚴(yán)重發(fā)病的地區(qū)番茄減產(chǎn)達(dá)25%～75%。目前，生產(chǎn)上還沒(méi)有快速有效的防治辦法，但番茄潰瘍病的快速檢測(cè)和鑒定已有大量研究[2-7]。

幾十年來(lái)，生產(chǎn)上對(duì)番茄潰瘍病采用過(guò)化學(xué)防治、生物防治和農(nóng)業(yè)措施防治，但均收效甚微，抗病育種或許是徹底根治該病害的最佳途徑。國(guó)內(nèi)外的專家大多采用常規(guī)手段進(jìn)行抗病育種，從本屬或近緣屬作物中尋找抗性資源，這樣可以盡快育出抗病品種。龍葵（Solanum.nigrum L）與番茄同屬茄科茄屬，是湖南地區(qū)普遍生長(zhǎng)的一種野草，湖南省蔬菜研究所課題組前期對(duì)龍葵進(jìn)行了調(diào)查以及病原菌接種鑒定，研究表明龍葵對(duì)番茄潰瘍病高抗。筆者以感病番茄98-1為母本、茄科茄屬龍葵為父本進(jìn)行雜交育種，進(jìn)行了四代回交和一代自交及SSR鑒定，以期獲得對(duì)番茄潰瘍病具有抗性的雜交后代群體及與番茄潰瘍病抗性相關(guān)的SSR標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 母本：番茄98-1，從臺(tái)灣引進(jìn)，定植于湖南省蔬菜研究所；父本：龍葵，從野外采集，定植于湖南省蔬菜研究所示范園。

1.1.2 引物序列 從http://www.gramene.org和http://www.ncbi.nlm.nih.gov/網(wǎng)站獲得110對(duì)SSR引物信息，由北京鼎國(guó)生物有限公司合成。試驗(yàn)所采用的引物序列信息如表1所示。

表1 部分SSR引物序列

1.2 方法

1.2.1 番茄育種 用番茄98-1作輪回親本，四代回交，再自交一代。2007年4月在龍葵開(kāi)花前采集花粉，對(duì)其進(jìn)行干燥和保存；5月在番茄花藥成熟但花朵未開(kāi)放時(shí)，進(jìn)行去雄并授以龍葵花粉，然后套袋；7月收種后立即播種，然后用番茄98-1作輪回父本和F1（98-1×龍葵）。2008年、2009年共回交四代，2010年自交一代，選取1 000份生長(zhǎng)健壯、植物學(xué)形態(tài)較好的材料進(jìn)行SSR鑒定和病理學(xué)接種鑒定。育種技術(shù)路線如圖1所示。

圖1 番茄育種技術(shù)路線

1.2.2 總DNA的提取及濃度檢測(cè) 在植株上直接取葉子，用簡(jiǎn)化的CTAB法[8]提取總DNA。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純度，用微量紫外分光光度儀測(cè)（ND-1000）檢測(cè)所提取DNA的濃度。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 以提取的總DNA為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系：10×Buffer（含 Mg2+）2.5 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，10 μmol/L 引物 1 μL，模板DNA 20 ng，Taq DNA polymerase 1U，補(bǔ)充 ddH2O至 25 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 5 min；94℃變性 1 min，55℃退火 1 min，72℃延伸 2 min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保存。

1.2.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 采用1×TAE（Tris-冰乙酸-EDTA，pH值8.0）電泳緩沖液，用1.0%的瓊脂糖凝膠作為載體，以λDNA/HindⅢ為Marker，每孔點(diǎn) 6 μL（DNA 5 μL，溴酚蘭 1 μL），在 100 V 電壓，70 mA電流條件下電泳1 h，EB（溴化乙錠）染色20 min，將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中拍照。

1.2.5 抗病鑒定 （1）田間接種鑒定：菌種來(lái)源于湖南省植物保護(hù)研究所，接種室選于封閉的玻璃溫室，接種的植株用紗網(wǎng)隔離。（2）SSR鑒定：每回交一代進(jìn)行鑒定，從BC4I1的不同株系中選出1 000株高抗的單株，從葉中提取DNA，以98-1作對(duì)照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖電泳檢測(cè)，尋找差異帶。

1.2.6 抗病材料的獲得 2008年春在湖南省蔬菜研究所日光溫室播種BC1代，進(jìn)行了分子標(biāo)記輔助選擇和抗病鑒定，選中25株植株分別進(jìn)行回交并單株收種，BC2、BC3只進(jìn)行田間接種鑒定，按株系收取高抗植株。2010年春將BC4播種于日光溫室大棚，進(jìn)行SSR抗病鑒定，同時(shí)進(jìn)行自交，從不同的株系中選出抗病且性狀好的單株取樣并留種。

2 結(jié)果與分析

2.1 具有抗性的雜交后代群體及其基因相關(guān)標(biāo)記的獲得

利用SSR標(biāo)記對(duì)親本和105個(gè)BC1群體進(jìn)行篩選，最終獲得1個(gè)與龍葵抗?jié)儾』蛳嚓P(guān)的標(biāo)記—CAT01（上游序列:GCTTTCGATCCCTCCACATA，下游序列：GATCCCTACAATCCTTGGTCC），擴(kuò)增片段大小為810 bp左右（圖2），其中25株雜種后代含有該標(biāo)記。利用該25株子代與母本進(jìn)行回交，通過(guò)接種潰瘍病菌，田間抗病鑒定篩選出5株抗病的單株，后陸續(xù)進(jìn)行3次回交得到BC2、BC3和BC4群體。在BC4不同的株系中選出1 000株含有標(biāo)記的植株，從這些植株中篩選出80株性狀好的單株進(jìn)行抗病性鑒定與自交，最終得到34個(gè)抗病且性狀優(yōu)良的株系。如圖3所示，對(duì)BC1群體中34株進(jìn)行SSR分子標(biāo)記篩選，樣品中有8株擴(kuò)增出與抗性相關(guān)的條帶，分別位于第1、5、9、10、11、13、18、20 泳道，都是復(fù)合帶，說(shuō)明母本里也含有抗性基因，可能是沒(méi)有表達(dá)的隱性基因。

2.2 轉(zhuǎn)育過(guò)程中抗病反應(yīng)及農(nóng)藝性狀的變化

2.2.1 抗病反應(yīng)的變化 對(duì)雜交后代接種番茄潰瘍病菌，觀察發(fā)現(xiàn)BC1、BC2代表現(xiàn)為中感，有番茄潰瘍病的典型病斑。但到了BC4代，部分植株表現(xiàn)為中抗和高抗，在接種處出現(xiàn)過(guò)敏性反應(yīng)癥狀，接近龍葵對(duì)潰瘍病的抗性。

2.2.2 果形的變化 BC1代時(shí)果形還主要接近龍葵，BC3代開(kāi)始接近番茄，但是也有龍葵型的，BC4代的果型已經(jīng)接近回交親本98-1，近小番茄。

2.2.3 植株高度的變化 BC1、BC2植株接近龍葵，高約60 cm，BC4開(kāi)始大幅度增高，植株高度接近番茄。

3 討論與結(jié)論

通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交可以將龍葵對(duì)潰瘍病的抗性介導(dǎo)給番茄，為防治番茄潰瘍病害提供了參考。通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇，可以更準(zhǔn)確、更省力的選擇目標(biāo)性狀，尤其是多基因控制的性狀。該研究以感病番茄98-1為母本、茄科茄屬龍葵為父本進(jìn)行雜交育種，經(jīng)過(guò)四代回交和一代自交，獲得了對(duì)番茄潰瘍病具有抗性的雜交后代群體，并得到了1個(gè)與番茄潰瘍病抗性相關(guān)的SSR標(biāo)記—CAT01。

經(jīng)過(guò)幾年轉(zhuǎn)育，研究發(fā)現(xiàn)番茄抗?jié)兓蚴怯啥嗷蚩刂频?，SSR分子標(biāo)記只代表其1個(gè)基因的某個(gè)片段或與其中1個(gè)抗病基因連鎖的片段，但沒(méi)有該標(biāo)記一定不具備抗性。因此，在后代中大量淘汰沒(méi)有該標(biāo)記的單株，可減少研究者的工作量，再通過(guò)田間鑒定確定真實(shí)抗病的單株，自交純化獲得高抗植株。

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