蔣斌元，張 齊，康 敏，王勝利，龔建華，洪亞輝

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.株洲市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，湖南 株洲 412000）

水稻是一種重要的糧食作物，是人類主要的糧食來源，提高水稻產(chǎn)量以及防治病蟲害一直是科研工作者們努力的方向[1]。普通野生稻是栽培稻的近緣祖先，保有許多寶貴的基因資源，是水稻突破性育種與生產(chǎn)的重要基因源[2-4]。在茶陵已發(fā)掘的新石器時(shí)代大塘文化遺址中發(fā)現(xiàn)了已碳化的谷物堆，由此可見，茶陵地區(qū)谷物種植歷史悠久，茶陵野生稻具有重要的研究價(jià)值。湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)研究室與株洲農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所合作，將茶陵野生稻的基因組DNA采用花粉管通道法[5]導(dǎo)入受體栽培稻R9810、RCP08-29，其中R9810這一系中獲得的后代已培育到第4代，表型各異，表現(xiàn)出明顯的耐寒能力并且具有對(duì)株洲當(dāng)?shù)氐疚敛【》N的抗性。筆者以茶陵野生稻及其導(dǎo)入后代為研究對(duì)象，輔以受體材料為對(duì)照，采用RAPD方法[6-9]研究總基因組導(dǎo)入后在遺傳上所造成的影響，旨在配合大田表型篩選，為后續(xù)有目的性地篩選試驗(yàn)材料提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為茶陵野生稻（W）、超級(jí)稻R9810（C）、 導(dǎo)入后代D4（1：ys09203；2：ys09004；3：ys090015；4：ys090026；5：ys090027c）

1.2 方法

1.2.1 總DNA的提取 將供試材料洗凈剪碎分別置于研缽中，加入液氮研磨破碎細(xì)胞，使用CTAB法[10]提取DNA，電泳檢測。

1.2.2 RAPD擴(kuò)增 經(jīng)過多次篩選確定使用引物（表1）與25 μL反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性 5 min；94℃變性 40 s，36℃復(fù)性 40 s，72℃延伸1 min，共計(jì)40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min。引物濃度為10 μM。隨機(jī)引物由華大基因合成，利用隨機(jī)引物對(duì)各樣品基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。

表1 RAPD隨機(jī)引物序列

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 對(duì)凝膠電泳圖譜進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，使用統(tǒng)計(jì)類軟件NTSYSpc 2.1，基于非加權(quán)組平均法（UPGMA）對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行聚類分析[11-13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻基因組DNA的提取

提取的水稻基因組DNA經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，顯示條帶清晰（圖1）。這說明所提取的水稻基因組DNA大分子較為完整，雜質(zhì)和DNA的降解均比較少，符合RAPD所需要的PCR模板要求。經(jīng)蛋白核酸測定儀測量，所提取的基因組DNA的A260/A280值為2.10，基本符合DNA的純度要求。

2.2 RAPD分析

用篩選出的18個(gè)RAPD隨機(jī)引物對(duì)各樣品基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，圖2為部分RAPD電泳圖。

對(duì)顯示的凝膠電泳圖譜進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，使用1和0表示帶的有和無（表2）。使用統(tǒng)計(jì)類軟件NTSYSpc 2.1基于UPGMA算法對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行聚類分析，做出聚類圖（圖3）?；谠摼垲悎D所顯示的遺傳關(guān)系，發(fā)現(xiàn)茶陵野生稻總DNA經(jīng)花粉管通道法導(dǎo)入栽培稻后，其導(dǎo)入后代在遺傳關(guān)系上表現(xiàn)各異，有仍然趨向于受體R9810的，如5號(hào)導(dǎo)入后代，也有隨機(jī)插入DNA片段后在遺傳距離上發(fā)生了改變的，如 1、2、3、4 號(hào)導(dǎo)入后代。

表2 隨機(jī)引物RAPD圖譜條帶讀取結(jié)果

3 討 論

采用花粉管通道法將茶陵野生稻的總基因組DNA導(dǎo)入栽培稻后，在表型上獲得了許多變異，筆者使用RAPD法在分子水平上對(duì)基因組導(dǎo)入所引起的變異進(jìn)行了分析說明。研究結(jié)果表明，茶陵野生稻在進(jìn)化上處于比較原始的位置，受體R9810與5號(hào)導(dǎo)入后代有著較近的親緣關(guān)系，5號(hào)材料在遺傳上并未出現(xiàn)很大的改變，而1、2、3、4號(hào)導(dǎo)入后代在遺傳上則受到了較大的改變，這些變化可能是由于DNA片段的隨機(jī)插入而引起，亦或者是僅限于所選引物進(jìn)行擴(kuò)增才會(huì)顯示的結(jié)果?？偠灾?，RAPD法能在某種程度上顯示出采用花粉管通道法將供體基因組DNA導(dǎo)入受體后所產(chǎn)生的后代在基因組水平的變化，能為后續(xù)選育試驗(yàn)提供一定的參考。與表現(xiàn)型相結(jié)合，通過對(duì)花粉管通道法導(dǎo)入總DNA后獲得的大量后代進(jìn)行歸類研究，能提高分類的準(zhǔn)確性。

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