王 萌 肖會(huì)敏 何 悅 曹 蔚 王四旺

第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，陜西西安 710032

菖遠(yuǎn)膠囊主要由石菖蒲、遠(yuǎn)志、人參、丹參、川芎等中藥組成，具有開竅通經(jīng)、醒神益智、破瘀行出、滋陰補(bǔ)氣之功效，主要用于智能衰退及意識(shí)障礙等。研究發(fā)現(xiàn)石菖蒲揮發(fā)油是該藥材中鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥作用的主要有效部位[1]，而揮發(fā)油中主要活性成分是細(xì)辛醚系列物，主要有α-細(xì)辛醚、β-細(xì)辛醚等[2]。遠(yuǎn)志具有益智安神、祛痰消腫的功效，主含遠(yuǎn)志皂苷[3]。本文旨在建立制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方法，采用薄層色譜法分別對(duì)制劑中遠(yuǎn)志、人參、丹參、川芎等藥材進(jìn)行鑒別，采用HPLC法對(duì)制劑中α-細(xì)辛醚的含量進(jìn)行測(cè)定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀，配2695分離單元，2996二極管陣列檢測(cè)器，Empower色譜工作站，自動(dòng)進(jìn)樣器，美國(guó)Waters公司；薄層成像儀，瑞士camag公司；RD200電子分析天平，德國(guó)sartorius公司。

1.2 試藥

α-細(xì)辛醚對(duì)照品（純度＞98%，Sigma-Aldrich chemie），購(gòu)自北京豐特斯化學(xué)試劑公司；人參皂苷Rg1對(duì)照品（批號(hào)：0703-200921）、人參皂苷 Re對(duì)照品（批號(hào)：0754-201017）、丹參酮ⅡA對(duì)照品（批號(hào)：0716-200911）、遠(yuǎn)志對(duì)照藥材（批號(hào)：0904-9904）、川芎對(duì)照藥材（批號(hào)：0918-9603）、丹參對(duì)照藥材（批號(hào)：923-200906），均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；菖遠(yuǎn)膠囊，批號(hào)：20110605、201106010、20110615，由第四軍醫(yī)大學(xué)藥物研究所研制；甲醇，色譜純，美國(guó)Honeywell公司；純水，由millipore純水儀制備（美國(guó)millipore公司）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 遠(yuǎn)志藥材薄層鑒別[4]

取本品內(nèi)容物2.0 g，加鹽酸無水乙醇20 mL，加熱回流30 min，冷卻，濾過，濾液加水30 mL，用氯仿振搖提取2次，每次20 mL，合并氯仿液，蒸干，殘?jiān)哟姿嵋阴? mL使溶解，離心，取上清液作為供試品溶液。另取遠(yuǎn)志對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液與陰性對(duì)照溶液（缺遠(yuǎn)志）。吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以展開劑甲苯-醋酸乙酯-甲酸（14.0∶4.0∶0.5）展開（展距 18.0 cm），取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性無干擾。見圖1。

2.2 人參藥材薄層鑒別[4]

取本品內(nèi)容物2.0 g，加氯仿40 mL，加熱回流1 h，棄去氯仿液，藥渣揮干溶劑，加水0.5 mL拌勻濕潤(rùn)后，加水飽和的正丁醇10 mL，超聲處理30 min，吸取上清液，加3倍量氨試液，搖勻，放置分層，取上層液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。同法制成陰性對(duì)照溶液（缺人參）。另取人參皂苷Re、Rg1對(duì)照品，加甲醇制成每毫升各含0.5 mg的混合溶液，吸取上述4種溶液各5～10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-醋酸乙酯-甲醇-水（15︰40︰22︰10）10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開（展距18 cm），取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性無干擾，結(jié)果見圖2。

2.3 丹參藥材與丹參酮ⅡA薄層鑒別[4]

取本品內(nèi)容物2.0 g，加乙醚10 mL，放置1 h（不停振搖），濾過，乙醚液低溫?fù)]干，殘?jiān)哟姿嵋阴ト芙?，作為供試品溶液。取丹參酮ⅡA對(duì)照品，加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。另取丹參對(duì)照藥材1.0 g，同法制成對(duì)照藥材溶液與陰性對(duì)照溶液（缺丹參）。吸取上述四種溶液各5 μL，分別點(diǎn)在同一硅膠G薄層板上，以展開劑苯-醋酸乙酯（19∶1）展開，取出，晾干。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性無干擾，結(jié)果見圖3。

2.4 川芎藥材薄層鑒別[5]

取本品內(nèi)容物5.0 g，加乙醚20 mL，超聲15 min，濾過，濾液揮去乙醚，殘?jiān)哟姿嵋阴? mL使溶解，作為供試品溶液。另取川芎對(duì)照藥材0.3 g，同法制成對(duì)照藥材溶液與陰性對(duì)照溶液（缺川芎）。吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)在同一硅膠G薄層板上，以展開劑正己烷-醋酸乙酯（9︰1）展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性無干擾，結(jié)果見圖4。

2.5 α-細(xì)辛醚含量測(cè)定[6]

2.5.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Kromasil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（58∶42）；檢測(cè)波長(zhǎng)：257 nm；流速：1.00 mL/min；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10 μL，在此條件下理論板數(shù)以 α-細(xì)辛醚峰計(jì)應(yīng)不低于4 000。見圖5。

2.5.2 溶液的制備

2.5.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取α-細(xì)辛醚對(duì)照品12.00 mg于10 mL量瓶，用50%甲醇溶解并定容至刻度即得濃度為1.20 mg/mL對(duì)照品溶液，將其作為母液。

2.5.2.2 供試品溶液的制備 取本品10粒，倒出內(nèi)容物，稱取0.5 g，置于25 mL量瓶中，加15 mL 50%甲醇，超聲處理30 min后，冷卻，加50%甲醇至刻度。搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液10.0 mL，置于25 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，作為供試品溶液。

2.5.2.3 陰性樣品溶液的制備 取不含石菖蒲的菖遠(yuǎn)膠囊10粒，按供試品下方法制備得陰性樣品溶液。

2.5.3 方法學(xué)考察

2.5.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別精密量取母液0.10、0.20、0.25、0.40、0.50、1.00 mL于10 mL量瓶中，加50%甲醇到刻度，濾過（濾膜 0.45 μm），進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。以橫坐標(biāo)（X）為濃度（mg/mL）、縱坐標(biāo)（Y）為峰面積的積分值進(jìn)行線性回歸，得線性方程：Y=11 291 939X-6 181 679（r=0.999 8）。結(jié)果表明，α-細(xì)辛醚質(zhì)量濃度線性范圍為0.12～1.20 mg/mL。

2.5.3.2 精密度試驗(yàn) 精密量取對(duì)照品溶液（α-細(xì)辛醚0.48 mg/mL）10 μL分別注入色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積。結(jié)果峰面積的積分值RSD為0.92%（n=6），表明該方法精密度良好。

2.5.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（α-細(xì)辛醚0.48 mg/mL）10 μL，分別在 0、1、2、4、8、12 h 依法測(cè)定。 結(jié)果 α-細(xì)辛醚的RSD=1.02%，表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品6份（批號(hào)：20110605），每份0.5 g，精密稱定，按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備溶液，測(cè)定。結(jié)果平均含量為0.36 mg/g（RSD=0.98%），表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量樣品粉末約0.5 g（批號(hào)：20110605，含量為 0.36 mg/g），共 6份，每份 0.5 g，精密稱定，分別加入對(duì)照品（取上述線性樣品0.12 mg/mL對(duì)照品溶液），按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果α-細(xì)辛醚平均回收率為99.69%，RSD為 1.33%（n=6），結(jié)果見表 1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.5.4 樣品含量測(cè)定

取3批樣品，每批樣各3份，按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見表2。

表2 菖遠(yuǎn)膠囊中α-細(xì)辛醚含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討論

上述薄層鑒別結(jié)果顯示各藥材均具有良好分離度，各個(gè)特征斑點(diǎn)在相應(yīng)的位置均出現(xiàn)，且陰性無干擾，說明有很好的專屬性。含量測(cè)定結(jié)果顯示精密度與重復(fù)性良好，加樣回收率高，所以該方法穩(wěn)定、可靠。

石菖蒲為君藥，揮發(fā)油含量較高[2]，α-細(xì)辛醚、β-細(xì)辛醚等是石菖蒲揮發(fā)油的主要有效成分，因此將含量測(cè)定指標(biāo)定為α-細(xì)辛醚，經(jīng)過方法學(xué)考察與3種試樣品驗(yàn)證，本方法穩(wěn)定，制劑中α-細(xì)辛醚含量穩(wěn)定均一。遠(yuǎn)志也為君藥，將其進(jìn)行薄層鑒別，檢出特征斑點(diǎn)，同時(shí)陰性無干擾；將臣藥人參及佐藥丹參、川芎等也進(jìn)行了薄層鑒別，具有良好分離度，檢出特征斑點(diǎn)且陰性無干擾。

綜上所述，由于上述TLC方法可檢出特征斑點(diǎn)，專屬性強(qiáng)，定量定方法具有準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠等優(yōu)點(diǎn)，因此將其列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案以控制該制劑質(zhì)量。

[1]胡錦官，顧健，王志旺．石菖蒲及其有效成分對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]．中藥藥理與臨床，1999，15（3）：19-21.

[2]劉春海，劉西京，楊華生．石菖蒲揮發(fā)油的GC-MS分析[J]．中醫(yī)藥學(xué)刊，2006，24（7）：1280-1281.

[3]馬菁菁，劉斌，羅躍娥.遠(yuǎn)志化學(xué)成分和藥理活性的研究進(jìn)展[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，11（12）：161-163.

[4]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].一部.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：6，57，123.

[5]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].一部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：38.

[6]董玉，石任兵，劉斌．石菖蒲有效部位中α-細(xì)辛醚、β-細(xì)辛醚的含量測(cè)定[J]．北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，30（5）：340-342.