朱 旭 梁永彪 鄭利平

南寧市第二人民醫(yī)院檢驗科，廣西南寧 530031

我國是鼻咽癌的高發(fā)國家，其發(fā)病率占頭頸部腫瘤的首位。已有大量的實驗研究表明，EB病毒（Ep.Stein-Barr virus，EBV）與鼻咽癌關(guān)聯(lián)密切，傳統(tǒng)的EB病毒相關(guān)抗體的檢測是診斷及監(jiān)測患者病情最常用的方法，但是它的敏感性和特異性較差[1]。本研究應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)對鼻咽癌患者血漿EBV-DNA進行檢測，旨在探討EBV-DNA在鼻咽癌診斷方面的價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2006年1月～2010年10月在筆者所在醫(yī)院住院的初診鼻咽癌患者50例為研究組，其中男33例，女17例；年齡23～72歲，平均（45.0±4.2）歲；病理類型：中分化鱗癌6例，低分化鱗癌44例。所有患者均未進行任何治療。選擇同期住院的頭頸部其他癌瘤患者20例作為病例對照組，其中男12例，女8例；年齡26～70歲，平均（46.2±3.9）歲；所有患者均有病理及細胞學診斷依據(jù)。以同期健康體檢者50例作為健康對照組，男26例，女24例；平均（41.0±4.4）歲。

1.2 研究方法

1.2.1 標本收集 所有對象均抽取3 mL的外周血，加入到EDTA抗凝試管中，離心后分離出2 mL血漿，保持-20℃凍存。

1.2.2 DNA抽提 上述20 mL血漿抽提DNA，EBV基因擴增試劑盒由中山大學達安基因診斷中心提供，儀器為Roche LightCycler型PCR儀（美國），檢測方法按說明書進行。

1.2.3 血漿EBV-DNA檢測采用熒光定量PCR法 上游引物：5’-CCCAA-CACTCCACCA-CACG-3’，下游引物：5’-TCT-TAGGAGCTGTCCGAGGG-3’，探針序列：5’-CTGTCTGTAAAGTCCAGC-CTCC-（TAMRA）-3’。擴增程序：93℃ 2 min，1個循環(huán)→ 93℃ 5 s，57℃ 45 s，40個循環(huán)→ 37℃，1 min，1個循環(huán)。518 nm為檢測波長，陽性定量參考品為 1×107、1×106、1×105、1×104拷貝 /mL的EBV-DNA 的BamHI-W片段陽性模板，小于最低檢出限（1×103拷貝/mL）為陰性。

1.2.4 EBV-DNA含量計算公式

C：為血漿中待測DNA的拷貝數(shù)（拷貝/mL）；Q：為1次PCR反應(yīng)后檢測到的 DNA拷貝數(shù)；VDNA：為抽提得到的DNA液總體積；VPCR：為用于PCR反應(yīng)的DNA液體積；VEXT：為用于抽提DNT的血漿總量。

比較鼻咽癌患者與各對照組血漿EB病毒DNA拷貝數(shù)，分析血漿游離DNA含量與鼻咽癌分期的關(guān)系，統(tǒng)計EBV-DNA陽性檢出率。

1.3 統(tǒng)計學處理

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，采用x2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

3組血漿EBV-DNA陽性檢出率顯示，鼻咽癌組患者血漿EBV-DNA陽性檢出率明顯高于病例對照組及健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），病例對照組及健康對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組血漿EBV-DNA檢出率[n（%）]

3 討論

鼻咽癌原發(fā)病灶比較隱蔽，臨床很難做出早期診斷，容易造成漏、誤診。因此，筆者旨在找出一種有效的可以做到早期檢測的方法。事實上已經(jīng)有大量的研究資料顯示，EBV與鼻咽癌之間存在著密切的聯(lián)系[2]，鼻咽癌患者血漿EBV-DNA水平與腫瘤復(fù)發(fā)關(guān)系密切。EBV屬于皰疹病毒，是一種DNA病毒，是自然界中普遍感染人類的病毒。鼻咽癌患者EBV-DNA檢測標本，多采用腫瘤組織、轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)以及外周血中血漿等。腫瘤組織和淋巴結(jié)標本雖然準確率最高，但取得比較復(fù)雜，操作不便，對患者痛苦較大，不能適用于鼻咽癌的篩查以及對病情的監(jiān)測。血漿標本獲取較方便，國外有研究顯示應(yīng)用全血標本比血漿可更大地提高檢測的敏感度。本研究采用熒光定量PCR技術(shù)定量檢測鼻咽癌患者外周血血漿中的EBV-DNA，結(jié)果顯示鼻咽癌組患者血漿EBV-DNA陽性檢出率為72%，顯著高于其他兩組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。本研究結(jié)果表明，血漿EBV-DNA水平可以作為監(jiān)測鼻咽癌療效的腫瘤標記物。應(yīng)用熒光定量PCR檢測血漿EBV-DNA是診斷鼻咽癌的有效方法，操作簡單，準確率較高，尤其適用于發(fā)病高危地區(qū)和高危人群的篩查。

[1] 李杰.血漿EBV-DNA檢測對鼻咽癌的診斷價值的探討[J].醫(yī)學檢驗與臨床，2011，22（1）：20-21.

[2] 廖勇，羅志強.血漿EB病毒DNA定量測定對鼻咽癌的診斷價值[J].中外耳鼻咽喉顱底外科雜志，2007，13（3）：186-187.