冀章章 夏 榮 梅陵宣

1.安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院口腔科，安徽合肥230601；2.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔內(nèi)科，安徽合肥230032

牙齒發(fā)育是由牙源性上皮與顱神經(jīng)嵴來源的間充質(zhì)相互作用的結(jié)果，研究表明一些生物信號分子在牙胚發(fā)育過程中呈時空特異性表達，并相互作用，調(diào)控細胞的生長和分化，決定牙胚發(fā)育的進程。在此階段機體攝入過量的氟會損傷成釉細胞，引起牙釉質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，致使氟牙癥的形成[1]，骨形成蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）作為牙齒發(fā)育階段的重要信號分子，其特異性發(fā)生機制目前尚無定論。本實驗通過研究小鼠下頜第一磨牙牙胚內(nèi)分泌期和成熟期成釉細胞形態(tài)改變及BMP-2的表達，探討氟引起牙釉質(zhì)發(fā)育障礙的可能原因。

1 材料與方法

1.1 一般材料

32只4日齡的ICR小鼠（安徽省實驗動物中心提供，SPF級），BMP-2單克隆抗體（Abcam公司，美國），SP法免疫組化試劑盒和DAB顯色劑（北京中杉公司），微量移液加樣器（50μL，中國），Nikon eclipase 80i顯微鏡及數(shù)碼成像系統(tǒng)（Nikon公司，日本），RM2245切片機（Leica公司，德國）。

1.2 方法

1.2.1 分組 按照隨機抽取及分配的原則，分別從8只母鼠窩內(nèi)抽取32只4日齡的ICR小鼠（雌雄各半），根據(jù)單次腹腔注射氟劑量的不同，平均分成兩組，每組16只，各組再平均分成實驗組和對照組，每組8只。將10 mg/kg（體重）（實驗組1）和20 mg/kg（體重）（實驗組2）的NaF分別單次注入實驗組動物腹腔內(nèi)，將等劑量的NaCl分別單次注入對照組動物腹腔內(nèi)，注射量均為10μL/g，完成后所有動物返回各自母親。在實驗前后監(jiān)測所有動物體重，分析不同濃度氟對體重變化的可能影響。

1.2.2 標本處理 所有小鼠在藥物注射24 h后被斷頸處死，含有下頜第1磨牙牙胚的下頜骨被分離并取出（其上不含有軟組織），立刻將其置于4%多聚甲醛液（4℃，現(xiàn)用現(xiàn)配）中固定24 h；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟定向包埋；從近遠中向沿頰面4μm連續(xù)切片，以多聚賴氨酸處理的載玻片撈片，在60℃烤箱中烤片12 h，備用。

1.2.3 HE染色 采用常規(guī)HE染色含有小鼠下頜第1磨牙牙胚的下頜骨，在光鏡下觀察不同發(fā)育階段成釉細胞的形態(tài)。

1.2.4 免疫組化染色 采用SP法。室溫下切片脫蠟至水，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，3% H2O2室溫下孵育10 min，0.01 mol/L、pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）沖洗3～5 min，甩去多余液體。滴加抗原修復(fù)，正常羊血清工作液封閉，室溫下10 min，傾去勿洗，滴加BMP-2單克隆抗體（1︰300），4℃濕盒過夜，PBS沖洗3～5 min（以0.01 mol/L PBS液代替一抗作陰性對照）。室溫下復(fù)溫半小時，滴加生物素標記二抗試劑，室溫下孵育30 min，PBS沖洗3～5 min。滴加辣根過氧化物酶標記的工作液，室溫下孵育30 min，PBS沖洗3～5 min。DAB/ H2O2反應(yīng)染色，蒸餾水充分沖洗后，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。將免疫組化染色結(jié)果在JEDA 810D形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)中進行灰度分析，BMP-2陽性染色為棕黃色。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對注射藥物24 h后的所有動物體重進行t檢驗，單因素方差分析（ANOVA）灰度值。

2 結(jié)果

2.1 藥物注射結(jié)果

所有動物實驗過程中均未見死亡，實驗動物和對照動物的體重在注射藥物24 h后的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 藥物注射24 h后動物的體重比較（±s，g）

表1 藥物注射24 h后動物的體重比較（±s，g）

藥物劑量 對照組（NaCl） 實驗組（NaF） tP 10 mg/kg 20 mg/kg 0.117 0.815 3.626±0.149 3.658±0.121 3.728±0.085 3.673±0.131 1.669 0.238

2.2 HE染色結(jié)果

對照組：處于分泌階段的成釉細胞中細胞核遠離基底膜，呈高柱狀整齊均勻排列，托姆斯突在靠近釉質(zhì)-牙本質(zhì)側(cè)形成，紅染的釉基質(zhì)均勻分布；處于過渡階段的成釉細胞形態(tài)顯著變短，其中包含退縮的托姆斯突；處于成熟階段的成釉細胞形態(tài)由高柱狀逐漸向矮立方狀轉(zhuǎn)化。

實驗組：氟引起的改變在兩組中幾乎相同，囊腔樣損害形成于部分分泌期和過渡期的成釉細胞下方，囊腔上方的成釉細胞高度變矮，正常的柱狀結(jié)構(gòu)喪失，扭曲變性，伴有不同程度的空泡性變，托姆斯突排列紊亂甚至消失，囊腔下方相對的部分釉質(zhì)表面出現(xiàn)不規(guī)則的陽性改變，但這些損害被限制在相對孤立的區(qū)域，兩組中成熟期成釉細胞及對應(yīng)的釉質(zhì)未發(fā)現(xiàn)組織學(xué)上的異常。見圖1。

圖1 實驗組磨牙組織學(xué)觀察（×400）

2.3 免疫組化染色結(jié)果

對照組中，BMP-2表達在牙乳頭細胞、成牙本質(zhì)細胞、星網(wǎng)狀層細胞、中間層細胞及成釉細胞中。實驗組與對照組相比，分泌期和過渡期的成釉細胞中陽性表達明顯減弱。見圖2。

運用成像系統(tǒng)分析標本玻片圖像的鏡下結(jié)果，量化后通過ANOVA檢驗不難看出，成熟期組P＞0.05，未見明顯變化，而隨著氟濃度的升高，BMP-2的表達逐漸減弱，二者呈負相關(guān)，且P值在分泌期和過渡期組中均＜0.01。見表2。

圖2 實驗組BMP-2在相關(guān)組織中的表達（×400）

表2 不同分化時期的成釉細胞中BMP-2表達情況比較（±s）

表2 不同分化時期的成釉細胞中BMP-2表達情況比較（±s）

分組 分泌期 過渡期 成熟期對照組實驗組1實驗組2 FP 133.313±4.949 161.750±4.132 203.875±2.997 704.151 0.000 141.063±4.553 166.500±4.721 206.875±3.643 600.234 0.000 154.688±7.181 159.000±7.616 159.500±4.504 1.838 0.177

3 討論

骨形成蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）最初被認為是具有骨誘導(dǎo)性的一種高效充質(zhì)細胞，轉(zhuǎn)化形成軟骨及骨組織，在之后的研究過程中人們進一步發(fā)現(xiàn)它是一組多功能生長因子，通過刺激新骨的形成和在上皮-間充質(zhì)中傳遞信號等方式影響器官功能發(fā)育[2]。BMPs是與骨和牙齒形成相關(guān)的生長因子，屬于轉(zhuǎn)化生長因子β超家族，在機體多種組織和器官的形態(tài)發(fā)生中起重要調(diào)控作用。在牙髓生物學(xué)領(lǐng)域，在牙胚發(fā)育、成牙本質(zhì)細胞分化和牙髓損傷修復(fù)中，BMP-2作為上皮間充質(zhì)之間的一種信號分子，通過細胞黏附分子、核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的表達、細胞外基質(zhì)的調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮一定的作用[3-5]。Nadiri A[6]發(fā)現(xiàn)，BMP-2不僅在成牙本質(zhì)細胞分化階段大量表達，而且在鼠牙胚發(fā)生和早期發(fā)育階段有表達且與BMP-4關(guān)系密切，二者共同參與調(diào)控同源盒轉(zhuǎn)錄因子表達，BMP-2、BMP-4同時短暫表達于成牙釉細胞和成牙本質(zhì)細胞分化過程中。Miyoshi K[7]認為，BMP-2 mRNA在帽狀期首先被檢測出來，胚胎發(fā)育的第14天（E14），牙尖部的內(nèi)釉上皮細胞中局限表達，在上皮中的轉(zhuǎn)錄2 d后喪失，隨后在牙乳頭的間充質(zhì)細胞有表達，鐘狀期、E17～E18，BMP-2 mRNA仍然表達于牙髓干細胞，此為牙乳頭的中心細胞，到了成牙本質(zhì)細胞、成釉細胞分化終末這種表達形式才消失。前成牙本質(zhì)細胞分化終末期時BMP-2 mRNA出現(xiàn)，其表達進一步增加于成牙本質(zhì)細胞分泌期，并且一直存在于這些細胞中直到出生后4 d。

學(xué)者們通過研究認為，氟斑牙的發(fā)生是由于在牙齒發(fā)育期間機體攝入過量氟所致，相關(guān)的形成機制主要有生物個體的差異；處于敏感階段的成釉細胞暴露在高濃度的氟中，使得后續(xù)形成的釉質(zhì)蛋白的降解和移除被延緩，釉基質(zhì)蛋白水解酶的分泌和活性降低，從而清除釉基質(zhì)的時間延長；氟對羥基磷灰石晶體的影響等[8-10]。本實驗筆者選擇4～5日齡小鼠第一磨牙牙胚為研究模型，可以同時觀察到作為釉質(zhì)形成唯一的上皮源性細胞——成釉細胞處于分泌期，過渡期和成熟期等不同的分化階段，經(jīng)歷增殖、分化以及形態(tài)功能的演變，并且與切牙相比，第一磨牙是有限生長的，與人類牙齒更接近。

通過連續(xù)切片可以看出：對于釉質(zhì)的正常形成起著決定性作用的部分成釉細胞下相對存在囊腔樣損害，受侵襲的程度以靠近囊腔的細胞最嚴重，對F-的敏感性隨著成釉細胞處于不同的分化階段而改變，這些形態(tài)學(xué)上的不利影響在處于成熟階段的成釉細胞中幾乎未見。筆者推測：本實驗藥物濃度條件下，在注射藥物24 h內(nèi)，成釉細胞形態(tài)上的明顯差異未曾發(fā)生，或是這些細胞發(fā)育時序相同，即由分泌階段向過渡階段轉(zhuǎn)化。這與Hirota L等的研究結(jié)果部分一致，他們認為攝入過量的氟很難對處于成熟期成釉細胞產(chǎn)生影響，卻能夠造成分泌期成釉細胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體的膨脹損傷，異位物質(zhì)壓迫托姆絲突致使紊亂、使得細胞的水腫變性、空泡形成成為可能[11]。

筆者認為可能在過量氟的影響下， BMP-2蛋白的表達被抑制， 進而引起成釉細胞的分化和隨后的基質(zhì)分泌功能低下，細胞形態(tài)和功能上的改變發(fā)生于分泌期和過渡期，造成功能性細胞數(shù)量減少，從而使得釉質(zhì)發(fā)育障礙，導(dǎo)致了氟斑牙的形成。這可能是高氟致使釉質(zhì)發(fā)育缺陷的機制之一。

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