王 波，李鵬飛，馬 萍，王 燕，劉麗宏

（1.第二炮兵總醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100088；2.泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 泰安 271016）

環(huán)孢素A（CyclosporinA，CsA）是一種強(qiáng)效免疫抑制劑，在臨床上主要用于器官移植的抗排異反應(yīng)和移植物抗宿主病，近年來(lái)也用于治療再生障礙性貧血、血小板減少性紫癜、狼瘡腎炎等多種難治性自身免疫性疾病[1]。由于CsA的生物利用度和藥動(dòng)學(xué)個(gè)體差異大、治療窗窄，血藥濃度過(guò)高將引起肝腎毒性，過(guò)低則發(fā)生排異反應(yīng)。因此，監(jiān)測(cè)CsA血藥濃度，并調(diào)整其濃度在有效范圍內(nèi)，具有重要的臨床意義。

治療藥物監(jiān)測(cè)作為臨床應(yīng)用CsA的前提條件是公認(rèn)的準(zhǔn)則。目前，國(guó)內(nèi)外常用的CsA監(jiān)測(cè)方法有熒光偏振法（TDx）、AxSYM免疫分析法、CEDIA克隆化酶供體免疫分析法、Emit均相酶測(cè)免疫分析法、高相液相色譜法（HPLC）、高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法（LC－MS/MS）等[2－7]。關(guān)于各種測(cè)定方法之間的比較，國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道[3－6]。TDx法對(duì)環(huán)孢素的體內(nèi)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生交叉免疫反應(yīng)，實(shí)際測(cè)得結(jié)果為CsA及代謝物之和[8]。CsA在肝臟和小腸中由細(xì)胞色素P450 3A代謝，其代謝產(chǎn)物有30多種，代謝物是否具有CsA免疫抑制作用或毒性仍不明確，在試管中分離的CsA代謝物最多有10%～20%CsA母體化合物的活性，代謝物結(jié)合體具有增效和協(xié)同作用[9－10]。LC－MS/MS法測(cè)定結(jié)果為 CsA 原型藥物濃度，能更準(zhǔn)確地說(shuō)明藥物濃度－療效－不良反應(yīng)三者之間的關(guān)系[11]。本研究擬以TDx監(jiān)測(cè)方法為參比，對(duì)CsA全血樣本進(jìn)行LCMS/MS分析，考察兩種方法的相關(guān)性，為L(zhǎng)CMS/MS法測(cè)定CsA全血濃度的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器與試藥

3200QTrap型液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國(guó)Applied Biosystems公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子化源（ESI）以及 Analyst 1.4.2數(shù)據(jù)處理軟件；Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng)：美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品，包括四元輸液泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、切換閥；電子天平（CP225D）；TDx快速血藥濃度測(cè)定儀：美國(guó)Abbott公司產(chǎn)品。

TDx全血環(huán)孢素試劑盒：美國(guó)Abbott公司產(chǎn)品；96孔MAS蛋白沉淀板：天津博納艾杰爾科技有限公司產(chǎn)品；CsA對(duì)照品（純度為98.8%，批號(hào)：0495－200202）：由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；CsD對(duì)照品（純度為95.0%，批號(hào)：09120731）：由上海同田生物技術(shù)有限公司提供；甲醇，乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；受試者給藥后收集的全血樣本和空白人全血由第二炮兵總醫(yī)院提供。

1.2 LC－MS/MS分析方法

1.2.1 色譜條件 Kromasil－C18色譜柱（20mm×4.6mm×5μm）；流動(dòng)相：甲醇－1mmol/L乙酸銨溶液；梯度洗脫，流速1.0mL/min；柱溫65℃；進(jìn)樣量10μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件 離子噴霧離子化源，正離子方式檢測(cè)；離子噴射電壓5 500V；溫度580℃；源內(nèi)氣體1（GS1，N2）壓力55psi，氣體2（GS2，N2）壓力60psi；氣簾氣體（N2）壓力20psi；碰撞氣體（N2）壓力：Medium；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；CsA、CsD解簇電壓（DP）分別為110、110eV，碰撞能量（CE）分別為55、90eV；CsA、CsD用于定量分析的離子反應(yīng)分別為m/z 1 202.4→675.6和 m/z 1 216.9→199.2；CsA用于定性分析的離子反應(yīng)為 m/z 1 219.9→1 202.9。

1.2.3 溶液的配制 對(duì)照品儲(chǔ)備液的配制：精密稱取10.0mg CsA對(duì)照品，置于10.0mL量瓶中，加入甲醇溶解，并稀釋至刻度，配制成1.0 g/L CsA儲(chǔ)備液。標(biāo)準(zhǔn)母液的配制：取10μL CsA儲(chǔ)備液，置于10mL量瓶中，加入空白全血溶解，并用空白全血稀釋至刻度，配制成1.0 mg/L CsA母液。標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本的配制：分別取CsA母液適量，用空白全血稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線所需濃度的全血溶液，濃度分別為10.0、30.0、100.0、300.0、1 000.0、1 500.0μg/L。分別取CsA母液適量，用空白全血稀釋至質(zhì)控樣本所需濃度的全血溶液，分別為30.0、300.0、1 200.0 μg/L。內(nèi)標(biāo)溶液的配制：精密稱取10.0mg CsD對(duì)照品，置于10.0mL量瓶中，加入甲醇溶解，并稀釋至刻度，配制成1.0g/L儲(chǔ)備液；精密量取5μL上述CsD儲(chǔ)備液，置于50mL量瓶中，加入甲醇溶解，并稀釋至刻度，即為100μg/L CsD溶液。紅細(xì)胞破碎劑的配制：精密稱取14.38g ZnSO4·7H2O，置于500mL量瓶中，加入蒸餾水溶解，并稀釋至刻度，即為100 mmol/L硫酸鋅溶液。

1.2.4 全血樣品處理 精密取50μL全血樣本，置于1.5mL EP管中，加入50μL紅細(xì)胞破碎劑，200μL內(nèi)標(biāo)CsD溶液，渦旋2min，以13 200r/min離心5min，取上清液，進(jìn)樣20μL，進(jìn)行LC－MS/MS分析。

1.2.5 MAS蛋白沉淀板法 將蛋白沉淀板的每孔加入2mL乙腈活化，負(fù)壓抽干，加入100 μL經(jīng)前處理后的全血樣品，100μL乙腈沉淀劑，渦旋3min，加負(fù)壓，收集上清液于接收板中，取上清液，進(jìn)樣20μL，進(jìn)行 LC－MS/MS分析。

1.3 TDx分析法

取150μL全血樣本，加50μL專用紅細(xì)胞破碎劑，混勻，再加入300μL蛋白沉淀劑，混勻，離心5min，取150μL上清液，置于TDx儀測(cè)定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，運(yùn)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件中pearson方法進(jìn)行相關(guān)性的統(tǒng)計(jì)。通過(guò)計(jì)算“（LC－MS/MS法測(cè)定濃度/TDx分析法測(cè)定濃度）×100%”的值來(lái)描述兩種方法之間的關(guān)系，并且進(jìn)一步探討治療窗。

2 結(jié)果

2.1 LC－MS/MS法和TDx分析法測(cè)定全血中環(huán)孢素A濃度

將27例CsA患者全血樣品經(jīng)前處理后，分別采用LC－MS/MS法和TDx法進(jìn)行濃度測(cè)定，LC－MS/MS法平行測(cè)定6次，TDX法測(cè)定1次，測(cè)試結(jié)果示于圖1?？梢奓C－MS/MS法測(cè)定CsA血藥濃度平均值為（99.9±62.7）μg/L，小于TDx法測(cè)定的濃度平均值（199.7±129.1）μg/L；兩種測(cè)試方法測(cè)定結(jié)果相關(guān)系數(shù)r平均為0.929，遠(yuǎn)大于不相關(guān)臨界值，證明兩種方法線性相關(guān)；LC－MS/MS法與TDx法測(cè)試受試者全血樣品濃度比值為（51.6±9.3）%。

2.2 MAS沉淀蛋白板與蛋白沉淀法測(cè)定環(huán)孢素A濃度

將同一批次19例全血樣品分別用MAS沉淀蛋白板和蛋白沉淀法進(jìn)行前處理，取兩者上清液進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，濃度變化示于圖2。將兩種測(cè)試方法比較，發(fā)現(xiàn)MAS沉淀蛋白板可以測(cè)得較高濃度，它能使細(xì)胞中的藥物釋放出來(lái)，并且樣品處理更干凈，濃度升高，且適合大批量樣品的處理。

圖1 LC－MS/MS法和TDX分析法測(cè)定全血中環(huán)孢素A濃度曲線圖Fig.1 The diagram of curves of concentration by LC/MS－MS and TDX

圖2 MAS沉淀蛋白板和蛋白沉淀法測(cè)定全血中環(huán)孢素A濃度曲線圖Fig.2 The diagram of curves of concentration by Cleanert MAS and precipitation of protein

3 討論

LC－MS/MS法測(cè)定的CsA血藥濃度小于TDx法測(cè)定結(jié)果，因?yàn)門Dx實(shí)際測(cè)得結(jié)果為環(huán)孢素及其代謝物之和，LC－MS/MS法測(cè)定結(jié)果為CsA原型藥物濃度，從而能更好的反映體內(nèi)藥物濃度變化。本研究將LC－MS/MS法和TDx分析法的測(cè)試結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)，相關(guān)性較好。LC－MS/MS法和TDx分析法自身配對(duì)比值平均值（51.6±9.3）%，可以根據(jù)此比值推測(cè)LC－MS/MS法適用于CsA血藥濃度監(jiān)測(cè)的治療窗。

本研究將兩種監(jiān)測(cè)方法的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較分析，為評(píng)價(jià)方法和推廣方法開創(chuàng)了新思路。TDx法簡(jiǎn)便、迅速，但需要特定的試劑盒，成本較高，測(cè)定結(jié)果偏高。LC－MS/MS法用血量少、分辨性能高、靈敏度高（10μg/L）、分析速度快、樣品監(jiān)測(cè)量大，對(duì)CsA的體內(nèi)代謝產(chǎn)物不存在交叉免疫反應(yīng)，更能反映藥效。因此，LC－MS/MS法可成為免疫抑制劑臨床血藥濃度監(jiān)測(cè)的常規(guī)方法。

環(huán)孢素A主要分布在全血中，血漿藥物濃度遠(yuǎn)低于全血藥物濃度，因此，本研究選用全血作為分析測(cè)試對(duì)象。采用 LC－MS/MS法和TDx分析法測(cè)定CsA血藥濃度，在不影響靈敏度的前提下，全血樣本均采用極其簡(jiǎn)便的沉淀蛋白法，節(jié)省了大量的前處理時(shí)間。在LC－MS/MS法試驗(yàn)中，選用環(huán)孢素D作為內(nèi)標(biāo)，與文獻(xiàn)[12]所用環(huán)孢素D一致，通過(guò)優(yōu)化柱溫、洗脫梯度、流動(dòng)相和內(nèi)標(biāo)加入量后，CsA和內(nèi)標(biāo)均得到較好的色譜峰。MAS沉淀蛋白板經(jīng)過(guò)活化，加入血樣后負(fù)壓抽濾，即可完成前處理過(guò)程，具有較好的除磷脂效果，能更好的保護(hù)實(shí)驗(yàn)儀器，且平行性良好，是一種高通量的樣品處理方法。

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