劉擁海,俞 樂,崔鐵成

(肇慶學院 生命科學學院，廣東 肇慶 526061)

結縷草基因遺傳轉化研究的相關進展

劉擁海,俞 樂,崔鐵成

(肇慶學院 生命科學學院，廣東 肇慶 526061)

結縷草（Zoysia spp．）主要分布在東亞，它是當前廣泛應用的有眾多優(yōu)良特性的暖季型草坪草．綜述了結縷草植株再生體系的高效建立方法、抗性基因遺傳轉化及轉基因結縷草對生態(tài)環(huán)境的影響，旨在為通過生物技術手段引入相關抗性基因增強結縷草的抗逆性及延長綠期等提供參考．

結縷草；遺傳轉化；綠期；抗寒性

結縷草（Zoysia spp．）是禾本科結縷草屬多年生暖季型草坪草，主要分布在亞洲．我國結縷草資源居世界首位．據有關資料顯示[1]，結縷草共有5個種廣泛用于草坪草生產開發(fā)和種質應用，它們分別是日本結縷草(Z．japonica Steud．)、細葉結縷草(Z．tenuifolia Willd．)、溝葉結縷草（Z．Matrella Merr．）、中華結縷草(Z．sinica Hance)和大穗結縷草(Z．macrostachya Franch．＆ Sav．)．而在結縷草遺傳轉化研究中，以日本結縷草為受體材料最為常見．

華南地區(qū)地處水熱條件十分優(yōu)越的南亞熱帶，具有發(fā)展常綠型草坪的良好條件．結縷草具有耐干旱、耐鹽、耐踐踏、耐瘠薄、耐低修剪、彈性高等眾多的優(yōu)良特性，是目前廣泛應用的暖季型草坪草種之一．不同種質的結縷草，因遺傳背景不同其抗寒性差異明顯，部分結縷草種仍存在抗寒能力等方面的不足，低溫條件下綠期短是它的致命缺點[2]，因此，提高暖季型草坪草的抗寒力是目前南方草坪業(yè)及高爾夫草坪事業(yè)發(fā)展面臨的一大難題．海南地區(qū)的結縷草即使在冬季也能夠保持常綠，這與該地區(qū)冬季氣溫較高有關，由此表明溫度可能是影響結縷草綠期長短的一個重要因素，所以通過導入外源基因提高結縷草的抗低溫能力，將對綠期延長有重要作用[3]．

1 結縷草植株再生體系的高效建立方法

基因的遺傳轉化技術可在基因水平上精確地定向改造植物遺傳性狀，提高育種的目的性和可操作性，打破物種之間的生殖隔離障礙．將外源抗寒、抗旱、耐鹽堿、抗病蟲等基因引進結縷草等廣泛栽培的草坪草中，在目前和今后相當長的時間內是科研人員最重要的工作目標之一[4]．

大量研究資料表明，正確選擇外植體是建立結縷草高效再生體系成功的關鍵．目前在結縷草植株再生體系的相關研究中，外植體可選擇莖尖、幼穗、幼胚、花序、匍匐莖節(jié)段或成熟的種子等．Yoon和Kin[5]對以結縷草莖尖為外植體成功建立植株再生體系進行了報道，并分析了2,4－D、BA對愈傷誘導及再生芽形成的影響；玄松南等[6]以幼穗、莖尖為外植體，成功建立了日本結縷草再生體系；Noh等[7]以不同發(fā)育階段結縷草的幼胚為外植體，從體胚發(fā)生途徑獲得了再生植株；Poeaim等[8]的研究表明，以結縷草的未成熟花序為外植體，可順利建立其植株再生體系；Inokuma等[9]以匍匐莖莖節(jié)為外植體建立了日本結縷草的懸浮培養(yǎng)體系．通常以幼穗、幼胚、匍匐莖等外植體來誘導結縷草胚性愈傷和建立再生體系，往往不需要繼代擴增也容易得到大量相同基因型的愈傷組織．不過幼穗、幼胚、匍匐莖等外植體取材易受季節(jié)和時間的限制，且不宜消毒，因此往往難以獲得合適的幼穗或幼胚等外植體[10]．成熟胚具有取材方便、消毒容易、愈傷組織誘導率高等優(yōu)勢，因此到目前為止，結縷草基因遺傳轉化的外植體仍以成熟胚為主[11－13]．大量研究資料顯示[11－14]，在用成熟胚為外植體誘導愈傷形成過程中會產生多種類型的愈傷形態(tài)，大部分為缺少2次生長能力的非胚性愈傷，因此一般都需選用胚性愈傷組織，或胚性細胞懸浮系及其原生質體來分化得到再生植株．劉擁海等[14]在前人研究基礎上，已建立一套簡易且高效的結縷草愈傷組織誘導和植株再生體系．

2 結縷草基因遺傳轉化的主要方法

在目前結縷草遺傳轉化研究中，基因槍法和根癌農桿菌介導法是2種得到廣泛應用的植物遺傳轉化技術．這2種方法各有優(yōu)勢和不足，基因槍法的最大優(yōu)勢是基因的轉化受體材料不受限制，目前在單、雙子葉植物遺傳轉化中得到廣泛應用．雖然基因槍法已成功應用于多種冷季型或暖季型草坪草的遺傳轉化中，不過利用該法成功轉化結縷草并獲得轉基因植株的報告尚不多見[15]．農桿菌介導法以其較高的轉化頻率、較低的外源基因插入拷貝數(shù)、較好的遺傳穩(wěn)定性、簡單的操作及便宜的設備等優(yōu)勢超越基因槍法[16]．研究資料表明，農桿菌介導法不僅成功地應用于雙子葉植物的遺傳轉化，而且近年來通過深入研究農桿菌侵染機理及改進侵染技術，在7個科20多種單子葉植物（包括禾本科植物）中應用農桿菌介導法轉化外源基因獲得成功，因此有效克服了農桿菌的宿主限制[17－18]．近10年來該方法已成功引入到結縷草基因遺傳轉化中．Chai和Kim[19]應用農桿菌介導法，成功將一些報告基因或抗除草劑基因導入由日本結縷草成熟胚誘導的胚性愈傷組織中，得到了再生植株，這也是世界上首次成功應用農桿菌介導法獲得結縷草轉基因植株的報道．隨后，Rahman等[20]報道了應用農桿菌介導法建立的日本結縷草高效轉化體系，由此農桿菌介導法在結縷草遺傳轉化中得到廣泛應用，越來越多的草業(yè)科學工作者應用該技術培育出高抗逆性及綠色期延長的結縷草新品系(種)．

3 結縷草遺傳轉化的外源基因選擇

早期的草坪草轉基因研究，除在匍匐翦股穎上較多引入抗除草劑基因及廣譜抗真菌的殼多糖酶基因外，結縷草等其他多數(shù)草坪草的引入主要為選擇標記基因和報告基因．Inocuma等[9]報道了通過聚乙二醇介導法，將一些抗除草劑基因及報告基因導入日本結縷草，成功獲得了最早的轉基因結縷草植株；隨后，Chai和Kim[19]以農桿菌介導法轉化hpt和gus基因，得到結縷草再生植株并觀測到gus基因的表達；Ge等[21]采用農桿菌介導法，首次通過直接侵染結縷草匍匐莖節(jié)點，成功獲得了轉hph和gus基因的植株．近年來，研究者們開始重視引入有經濟價值的基因，轉化的目標主要是為了提高結縷草的抗逆性和延長綠期．Toyama等[22]以農桿菌介導法實現(xiàn)bar基因的轉化，獲得抗除草劑雙丙氨膦的日本結縷草轉基因植株；齊春輝等[23]獲得了轉入DREBIA基因的日本結縷草植株．章家長等[24]報道了將擬南芥ipt基因導入結縷草胚性愈傷組織中，成功得到了延緩衰老、綠期延長的結縷草轉基因植株；而Li等[25]將擬南芥的CBF1基因導入中華結縷草中，得到的轉基因植株的耐冷性比野生型植株有較大提高，衰老速率得到明顯延緩．葉綠體是高等植物細胞重要的光合場所，葉綠體DNA中含有不少參與光合作用的重要基因，草業(yè)科學家希望通過調控葉綠體相關光合基因的表達改善其光合性能，培育出四季常綠的結縷草新品種．核酮糖－1,5－二磷酸羧化酶/加氧酶（ribulose 1,5－bisphosphate carboxylase/oxygenase,Rubisco,EC 4.1.1.39)是大量存在于葉綠體中的一種蛋白質，也是光合作用的關鍵酶之一，該酶蛋白含大、小2種不同亞基，其中大亞基由葉綠體DNA負責編碼．日本科學家[26]的研究表明，含Rubisco啟動子的轉基因日本結縷草植株，若對葉片給予光照即能誘導Rubisco基因的表達．通過有效調控Rubisco基因表達目的手段而延緩結縷草的衰老，將是人們期望實現(xiàn)的目標之一．此外，對于光合作用的另一個關鍵酶——編碼磷酸烯醇丙醇酸羧基激酶，科學家們將其基因成功導入日本結縷草后，得到的轉基因植株可顯著提高光合性能，即使在冬季也可使植株保持常綠[27]．

在外源基因轉化方面，結縷草等暖季型草坪草與冷季型草坪草相比發(fā)展較為遲緩，后者可以說已進入了轉抗性基因時代．Hu等[28]的研究表明，將玉米Ubi啟動子驅動的ipt基因成功導入高羊茅中，得到轉基因植株的耐寒能力明顯提高，冬季綠期天數(shù)顯著增加．Hisano等[29]的研究表明，將小麥果聚糖轉移酶基因成功轉化黑麥草，獲得的轉基因植株可積累高含量的果聚糖，植株耐寒力得到明顯增強．McKersie等[30]應用農桿菌介導法成功將煙草的超氧化物歧化酶cDNA序列轉化苜蓿后，得到的轉基因植株抗凍能力及抗除草劑能力均大大提高．Aswath等[31]在匍匐翦股穎上引入了明顯提高抗干旱和耐鹽性的脅迫誘導基因．此外，Ye等[32]在黑麥草上引入了抗蟲基因．Salehi等[33]將細菌中編碼內毒素因子的cry1Ac基因成功導入百慕大草坪草，得到的轉基因植株能有效抵抗黑毛蟲的危害．Fu等[34]報道了將水稻的TLPD34基因導入匍匐翦股穎，可以提高其對硬幣元狀斑病及褐斑病的免疫能力．Guo等[35]的研究結果表明，將擬南芥受體蛋白激酶PR5K基因導入匍匐翦股穎，得到的轉基因植株可以有效抵抗硬幣元狀斑病害．Green等[36]將幾丁質酶基因導入匍匐翦股穎愈傷組織,獲得了轉基因植物，并篩選出2個株系，這2個株系對紋枯?。≧hizoctonia solani）的抗性明顯高于其親本．綜上所述，在冷季型草坪草的基因遺傳轉化研究中，選擇轉化的外源基因較多，既有抗寒、抗凍、抗旱等非生物逆境的基因，又有抗病、抗蟲等抗生物逆境的基因，并已取得了較好的成效；因此，作為暖季型草坪草的重要代表結縷草，其基因遺傳轉化研究仍有較大的發(fā)展空間．

4 轉基因結縷草的生態(tài)安全性考量

相對于野生型結縷草品種，轉基因結縷草一般具有高抗逆性和綠期延長等優(yōu)勢，勢必將更多被引入到諸如運動草坪、高爾夫球場及庭院綠化等環(huán)境中．不過人們擔心一旦轉基因結縷草大規(guī)模向大田釋放可能會產生生態(tài)安全問題．歸納起來，擔心的問題主要有2個[37]：一是認為轉基因結縷草中的外源基因可能隨著花粉釋放時與野生雜草雜交，進而發(fā)生基因漂移，使雜草獲得超強的抗逆能力，從而產生潛在的生態(tài)風險；二是擔心已導入抗性基因的轉基因結縷草比野生型草種具有更強的競爭能力，勢必會侵占野生草種的生存環(huán)境，從而破壞生物多樣性．不過，相關研究資料表明這種擔心可能是多余的．最近Bae等[38]的研究結果表明，從實驗室得到的轉基因日本結縷草釋放到大田栽培并不會產生嚴重的環(huán)境風險．他們發(fā)現(xiàn)轉基因結縷草抗除草劑基因并未在臨近的雜草中檢測到，雖然在野生型結縷草中檢測到該基因，但平均僅為6%，并且相距越遠，基因漂移的影響越小，當距離超過3 m就檢測不到影響了．此外，在其他的轉基因作物中也發(fā)現(xiàn)類似的結果．Celis等[39]的研究表明，種植在安第斯山脈的轉基因馬鈴薯，僅僅與種在附近的野生型馬鈴薯有交流，對周邊其他物種植物基本無影響．路興波等[40]的研究結果表明，轉基因玉米外源基因漂移僅在種內發(fā)生，并且漂移程度與花粉漂移的頻率和距離呈現(xiàn)正相關，在不同物種間基因飄移的可能性非常?。畯囊陨涎芯抠Y料可以看出，只要對轉基因結縷草的生長環(huán)境管理得當，對基因飄移是可以有效控制的．

5 結語

結縷草作為草坪草種質的主要缺點是生長緩慢、生長期短和抗寒性差，因此育種目標多為提高其生長和恢復速度及增強它對極端溫度的耐性，還有在低養(yǎng)護情況下延長其生長季節(jié)等方面[41]．華南地區(qū)地處水熱條件十分優(yōu)越的南亞熱帶，具有發(fā)展常綠型草坪的良好條件．該地區(qū)用作運動草坪的植物種類約有10種，但真正大面積種植的只有少數(shù)幾種，而在冬季能基本保持青綠的就更寥寥無幾；因此，將現(xiàn)代生物技術與傳統(tǒng)育種手段相結合研究和培育抗逆性結縷草新品種，尤其是能在冬季保持青綠的高抗寒性新品種，是提高南方地區(qū)草坪質量的重要前提．

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Recent Advance in Genetic Transformation of Zoysiagrass

LIU Yonghai,YU Le,CUI Tiecheng

(College of Life Sciences,Zhaoqing University,Zhaoqing,Guangdong 526061,China)

Zoysiagrass(Zoysia spp.),mainly originated in East Asia,is a warm-season turfgrass with its many excellent properties.This paper covers the efficient establishing method of plant regeneration system for zoysiagrass,genetic transformation of exogenous resistance gene,and ecological environmental risk of transgenic zoysiagrass.The information will be useful for genetically improved cultivars with enhanced stress tolerance and extended greening periods through the biotechnology means.

zoysiagrass;genetic transformation;greening periods;cold resistance

S688

A

1009－8445（2012）05－0036－05

(責任編輯：陳 靜)

2011－11－24

廣東省自然科學基金資助項目(S2011040001280);肇慶學院科學研究基金資助項目(201003,201102)

劉擁海(1972－),男,湖南邵東人,肇慶學院生命科學學院副教授,博士．