呂志強(qiáng)，朱曦齡，郭曉東，馬立芝

(武警總醫(yī)院急救醫(yī)學(xué)中心，北京100039)

·基礎(chǔ)研究·

Galectin-1在大腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)及意義

呂志強(qiáng)，朱曦齡，郭曉東，馬立芝

(武警總醫(yī)院急救醫(yī)學(xué)中心，北京100039)

目的 探討Galectin-1在大腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況，以及與大腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法用Real time-RT PCR法和免疫組織化學(xué)法分析Galectin-1mRNA及蛋白在5種大腸癌細(xì)胞系的表達(dá)情況;用Boyden小室法比較5種大腸癌細(xì)胞系的侵襲轉(zhuǎn)移能力。結(jié)果 Galectin-1在大腸癌轉(zhuǎn)移灶來(lái)源的細(xì)胞系中的表達(dá)高于大腸癌原發(fā)灶來(lái)源的細(xì)胞系(P＜0.01);Boyden小室的結(jié)果顯示大腸癌轉(zhuǎn)移灶來(lái)源的細(xì)胞系的侵襲，轉(zhuǎn)移能力高于大腸癌原發(fā)灶來(lái)源的細(xì)胞系。結(jié)論 Galectin-1的高表達(dá)可能與大腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移有一定關(guān)系。

結(jié)直腸腫瘤;凝集素類(lèi);腫瘤轉(zhuǎn)移;腫瘤侵潤(rùn)

大腸癌為消化道常見(jiàn)惡性腫瘤。近年來(lái)，大腸癌在我國(guó)發(fā)病率及死亡率均呈上升趨勢(shì)。其中腫瘤早期轉(zhuǎn)移是死亡的關(guān)鍵原因，所以研究與大腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移的相關(guān)因素，探索新的抗腫瘤途徑對(duì)于臨床治療具有重要的意義。

Galectins屬于凝集素家族，是人體內(nèi)大量存在的一大類(lèi)糖結(jié)合蛋白。它參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及免疫調(diào)節(jié)等多種生物功能［1］。Galectin-1是該家族中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的成員，研究表明，它與腫瘤的轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)、生長(zhǎng)和粘附有關(guān)［2］，目前已進(jìn)入臨床試驗(yàn)研究［3］。在本研究中，我們觀察Galectin-1在不同轉(zhuǎn)移能力的大腸癌細(xì)胞系的表達(dá)，分析其在腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 人大腸癌細(xì)胞株 LoVo、SW620、SW480、HT29、LS174T購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所。SW620與LoVo來(lái)源于大腸癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，具有較高的侵襲轉(zhuǎn)移能力;SW480，HT29和LS174T都來(lái)源于大腸癌的原發(fā)病灶，侵襲轉(zhuǎn)移能力相對(duì)較低。

1.2 主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco公司)，TRIzol購(gòu)自Invitrogen公司，SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，Reverse Transcription System試劑盒購(gòu)自Promega公司，侵襲小室(Boyden小室)購(gòu)自Chemicon公司，鼠抗人Galectin-1單克隆抗體、免疫組織化學(xué)染色試劑盒SP-9000購(gòu)自武漢博士德公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞株 LoVo、SW620、SW480、HT29、LS174T至于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)基采用含10%胎牛血清的RPMI1640。

1.4 Real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞系中Galectin-1 mRNA的表達(dá)

1.4.1 RNA的制備 待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好、鋪滿(mǎn)瓶壁后，提取細(xì)胞總RNA，參照TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)。

1.4.2 cDNA第1鏈的合成 按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)總體系為20 μl。42℃反應(yīng)1 h，95℃滅活逆轉(zhuǎn)錄酶5 min。

1.4.3 熒光定量PCR(Real-time RT－PCR) 基因β-actin作為內(nèi)參，同時(shí)檢測(cè)Galectin-1和β-actin的表達(dá)，計(jì)算出樣本中Galectin-1mRNA的相對(duì)表達(dá)量，以Folds=2－ΔΔCt表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組目的基因表達(dá)的倍比關(guān)系［4］，ΔΔCt=［Ct(target gene)－Ct (β-actin)］實(shí)驗(yàn)組－［Ct(target gene)－Ct(β－actin)］對(duì)照組。重復(fù)3次，計(jì)算平均值。在本實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組為SW620，LoVo，HT29、LS174T;對(duì)照組為SW480。采用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物。應(yīng)用Mx3000P定量 PCR儀(Stratagene)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)條件為94℃ 30 s，55℃30 s，72℃30 s，45個(gè)循環(huán)，熒光信號(hào)檢測(cè)。

1.5 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)Galectin-1在大腸癌細(xì)胞系中的表達(dá) 免疫組織化學(xué)方法按照說(shuō)明書(shū)常規(guī)操作。以鼠抗人Galectin-1單克隆抗體(1∶200)為一抗，以羊抗鼠為二抗(即用型抗體)，用蘇木素進(jìn)行復(fù)染細(xì)胞核。出現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性，按照顏色深淺，分為弱陽(yáng)性(+)、陽(yáng)性(++)與強(qiáng)陽(yáng)性(++ +)。

1.6 細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn) 應(yīng)用Boyden小室法［5］，該小室是利用Engelbreth Holm-Swarm(EHS)小鼠腫瘤組織成分重新構(gòu)建的人工基底膜ECMatrixTM，小室孔徑為8.0 μm。

實(shí)驗(yàn)前將Boyden小室從冰箱中取出，置于培養(yǎng)箱中，使之溫度調(diào)節(jié)到37℃。在內(nèi)室中加300 μl無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中孵育1～2 h，使ECMatrix層親水。細(xì)胞用胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，無(wú)血清的RPMI1640洗3遍后，細(xì)胞計(jì)數(shù)，上室接種腫瘤細(xì)胞300 μl(含1×105個(gè)細(xì)胞);用500 μl含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基作為趨化因子置于下室。37℃、5%CO2濕化培養(yǎng)箱內(nèi)孵育48 h，取出小室，用棉簽擦去上室內(nèi)未穿過(guò)濾膜的細(xì)胞，取出濾膜，中性甲醛固定，蘇木素染色。在200倍光鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野計(jì)數(shù)，取其均值代表浸潤(rùn)力量值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理，Real-time RT－PCR的結(jié)果采用析因設(shè)計(jì)的方差分析，體外侵襲實(shí)驗(yàn)的結(jié)果采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析，兩兩之間的比較采用LSD法。

2 結(jié)果

2.1 Galectin-1 mRNA在細(xì)胞中的表達(dá) 細(xì)胞總mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，在溶解曲線(xiàn)上未見(jiàn)到雜峰，說(shuō)明沒(méi)有非特異性擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物單一。從擴(kuò)增曲線(xiàn)可見(jiàn)所有樣品均已進(jìn)入平臺(tái)期，說(shuō)明反應(yīng)條件準(zhǔn)確。產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖電泳鑒定，5個(gè)不同的樣品擴(kuò)增得到的產(chǎn)物單一，符合引物設(shè)計(jì)時(shí)的擴(kuò)增長(zhǎng)度(195bp)。通過(guò)對(duì)各樣本Ct值進(jìn)行計(jì)算分析，以SW480為對(duì)照組，其余各細(xì)胞系為實(shí)驗(yàn)組，結(jié)果發(fā)現(xiàn) SW620，LoVo，LS174T，HT29中 Galectin-1 mRNA的表達(dá)水平分別是SW480的13.7，6.8，1.21，0.47倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 Galectin-1的免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果 Galectin-1在SW620中表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性，在SW480中表達(dá)呈弱陽(yáng)性。

2.3 5種細(xì)胞系體外侵襲實(shí)驗(yàn) 48 h后可以看到腫瘤細(xì)胞降解濾膜上的人工基底膜膠，并穿過(guò)微孔，結(jié)果顯示各細(xì)胞系的浸潤(rùn)能力為SW620(132.6± 13.4)，LoVo(118.9±17.2)高于SW480(96.2±10.3)，LS174T(70.2±5.9)，HT29(52.1±7.8)(P＜0.05)。

3 討論

Galectin-1屬于凝集素家族，國(guó)內(nèi)外許多研究已經(jīng)證實(shí)，其在黑色素瘤［6］、胰腺癌［7］、前列腺癌、甲狀腺腫瘤、結(jié)腸癌、膀胱癌及卵巢癌等多種腫瘤中的表達(dá)增高，并與其發(fā)生及轉(zhuǎn)移相關(guān)［8-9］。近年來(lái)，研究證實(shí)了Galectin-1能通過(guò)調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架，促進(jìn)腫瘤血管生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移［10-11］。

在本研究中，SW480，HT29和LS174T都來(lái)源于大腸癌的原發(fā)病灶，SW620和LoVo來(lái)源于大腸癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Galectin-1 mRNA在大腸癌轉(zhuǎn)移灶來(lái)源的細(xì)胞系(SW620，LoVo)中的表達(dá)高于原發(fā)灶來(lái)源的細(xì)胞系(SW480，HT29，LS174T)。通過(guò)免疫組織化學(xué)，發(fā)現(xiàn)Galectin-1蛋白在轉(zhuǎn)移灶來(lái)源的大腸癌細(xì)胞系SW620中表達(dá)為強(qiáng)陽(yáng)性，而在原發(fā)病灶來(lái)源的細(xì)胞中表達(dá)呈弱陽(yáng)性。某一特定的腫瘤組織中，并不是所有的細(xì)胞都具有相同的轉(zhuǎn)移能力，只有一部分細(xì)胞具有較高的轉(zhuǎn)移能力，可以形成轉(zhuǎn)移灶。也就是說(shuō)來(lái)源于轉(zhuǎn)移灶的腫瘤細(xì)胞，可能具有某些使其運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，促進(jìn)其轉(zhuǎn)移的物質(zhì)。通過(guò)Boyden小室實(shí)驗(yàn)，我們證實(shí)了來(lái)源于轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞系的侵襲轉(zhuǎn)移能力在體外高于原發(fā)灶來(lái)源的細(xì)胞系。由此，認(rèn)為Galectin-1的高表達(dá)與細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力有一定的相關(guān)性。

［1］ Barrow H，Rhodes JM，Yu LG，The role of galectins in colorectal cancer progression［J］.Int J Cancer，2011，129 (1):1-8.

［2］ Rabinovich GA.Galectin-1 as a potential cancer target［J］.Cancer，2005，92(7):1188-1192.

［3］ Banh A，Zhang J，Cao H.Tumor galectin-1 mediates tumor growth and metastasis through regulation of T-cell apoptosis［J］.Cancer Res，2011，71(13):4423-4431.

［4］ Livak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using Real-Time Quantitative PCR and the-2△△CT method［J］.Methods，2001，25(4):402-408.

［5］ Favaro PM，Traina F，Vassallo J，et al.High expression of FMNL1 protein in T non-Hodgkin＇s lymphomas［J］.Leuk Res，2006，30(6):735-738.

［6］ Lefranc F，Mathieu V，Kiss R.Galectin-1-mediated biochemical controls of melanoma and glioma aggressive behavior［J］.World J Biol Chem，2011，2(9):193-201.

［7］ Xue X，Lu Z，Tang D.Galectin-1 secreted by activated stellate cells in pancreatic ductal adenocarcinoma stroma promotes proliferation and invasion of pancreatic cancer cells:an in vitro study on the microenvironment of pancreatic ductal adenocarcinoma［J］.Pancreas，2011，40 (6):832-839.

［8］ Danguy A，Camby I，Kiss R.Galectins and cancer［J］.Biochim Biophys Acta，2002，1572(2/3):285-293.

［9］ Barrow H，Rhodes JM，Yu LG.The role of galectins in colorectal cancer progression［J］.Int J Cancer，2011，129 (1):1-8.

［10］Espelt MV，Croci DO，Bacigalupo ML.Novel roles of galectin-1 in hepatocellular carcinoma cell adhesion，polarization，and in vivo tumor growth［J］.Hepatology，2011，53(6):2097-2206.

［11］Thijssen VL，Postel R，Brandwijk RJ，et al.Galectin-1 is essential in tumor angiogenesis and is a target for antiangiogenesis therapy［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103(43):15975-15980.

The expression of Galectin-1in human colorectal carcinoma cells and its significance

LV Zhi-qiang，ZHU Xi-ling，GUO Xiao-dong，MA Li-zhi(Emergency Center，General Hospital of Armed Police Forces，Beijing 100039，China) Corresponding author:GUO Xiao-dong，E-mail:Guoxiaodong59122@sina.com

Objective To explore the expression of Galectin-1 gene in colorectal cancer cell lines and its correlation with tumor metastasis.Methods Expression of Galectin-1 in colorectal cancer cell lines was detected by Real time－RT PCR and imunohistochemistry.In vitro invasiveness was determined by Boyden chamber assay.The correlation of Galectin-1 expression with the invasive ability was also analyzed.Results Galectin-1 was highly ex-pressed in LoVo and SW620.In vitro，cell invasivion demonstrated that LoVo and SW620 had a higher invasive ability than LS174T，SW480 or HT29.Conclusion Galectin-1 may play an important role in invasion and metastasis of colorectal cancer.

Colorectal neoplasms;Agglutinins;Neoplasm metastasis;Neoplasm invasiveness

R735.34

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2012.04.022

2012-01-09)

呂志強(qiáng)，主治醫(yī)師，E-mail:wjjzklzq@163.com

郭曉東，副主任醫(yī)師，E-mail:Guoxiaodong59122@sina.com